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原因不明无菌性脑膜炎爆发的病原确定及其全基因序列分析

赵雅男  
【摘要】:2003年1月到7月在我国江苏省北部的盐城地区发生了一起较大规模的脑膜炎爆发流行。期间报告病例数共计1681例,其中99%的患者为年龄不超过15岁的儿童。根据流行特征、患者的主要临床表现和脑脊液细菌学检查结果,初步将此次疫情诊断为一次病原不明的无菌性脑膜炎爆发。 本课题通过问卷调查收集了此次脑膜炎爆发的基本资料,总结了流行概况。为明确病因,本研究还同时采集了204份来自于204例临床确诊为无菌性脑膜炎患者的脑脊液(CSF,cerebrospinal fluid)标本,以及4份采自另外4例患者的粪便标本。采用细胞培养法进行病原分离。第一阶段病原分离在传代细胞系Vero(非洲绿猴肾细胞)和HEp-2(人喉癌细胞)中进行,204份CSF无一例引起阳性细胞病变(CPE,cytophathic effect);继而先后引入两种来源于人体胚胎的细胞系MRC-5(人胚肺细胞)和293(人胚肾细胞)进行第二阶段的病原分离,结果发现66份接种于MRC-5细胞系的CSF中有18份产生了典型肠道病毒样细胞病变,4例粪便标本在该细胞系上也均出现阳性反应;而24份接种于293细胞系的CSF标本则没有检测到CPE。对分离阳性毒株通过电镜了解其外部形态。然后提取病毒RNA、利用肠道病毒5′端非编码区的高保守性,以两对肠道病毒通用引物引导的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR,reverse transcription-polymerase chain reaction)扩增相应片段,结果表明所有22株分离毒株都属于肠道病毒。 对分离毒株的型别鉴定从血清学和分子生物学两个角度分别进行。用肠道病毒组合抗血清(KMB)和其他未包括在KMB中的单价抗血清对分离病毒进行中和试验,结果表明所有分离阳性毒株都是埃可30型肠道病毒(Echo30,Echovirus 30)。根据肠道病毒基因组VP1区段的型别特异性,用简并引物扩增出病毒的VP1基因片段,对扩增产物测序,在GenBank数据库中用BLAST程序进行核酸序列比对得到分离毒株的基因分型。结果显示前20位与本次测序分离毒株VP1区段高度同源的都是Echo30型病毒,与上述中和试验得到的血清分型结果一致,从而初步判断Echo30型肠道病毒可能是本次无菌性脑膜炎爆发流行的病因病


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