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新型抗肿瘤转移多肽(β肽)的基因工程制备及其生物学效应

王松梅  
【摘要】:肿瘤细胞的高转移特性与肿瘤细胞的高粘附特性有关。阻断肿瘤细胞的粘附可能是预防肿瘤转移和复发的最佳途径。本研究在前人工作的基础上,设计了三个β肽(DLYYLMDLSYSMK)的重复序列(DLYYLMDLSYSMKGGDLYYLMD LSYSMKGGDLYYLMDLSYSMK,β3),尝试用基因工程的方法构建pET-His-β3表达载体,然后在大肠杆菌表达系统中表达,并进一步研究基因工程表达出的β3(简称基工β3)的抗肿瘤细胞粘附和迁移侵袭的活性及其对肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶的影响,以期为抗肿瘤转移药物的生产探索新的途径。 根据大肠杆菌的偏爱密码子人工合成了β3的基因序列。并同时采用6种融合蛋白表达载体表达β3,以尽快筛选出高效表达载体。结果可见,各种表达载体的表达情况不同。在pGEX4T-1中,β3可以得到明显表达,表达产物GST-β3为包涵体,表达量约为细菌总不溶性蛋白量的40%。利用其载体上编码的GST蛋白用Glutathione Sepharose 4B作为亲和介质可纯化出一定量的GST-β3融合蛋白。而用pMBP-P表达载体、pTrc-CKS表达载体和pET-DsbA表达载体,β3均未得到满意表达。在pET22b(+)中,β3获得了一定的表达。表达量可达细菌总蛋白的5.5%。从表达产物的分子量大小来判断,载体的pel B分泌信号并未被切除。 用pET-His表达载体,β3可以得到一定的表达,表达产物His-β3也是以包涵体的形式存在的。表达量约占细胞总蛋白的4%,占细胞总不溶性蛋白的10%。在变性条件下用金属螯合琼脂糖凝胶6B FF柱亲和层析,可以从每升细菌培养液中得到纯度为92.2%的His-β3融合蛋白20毫克。提示pET-His表达系统是高效表达β3的合适的表达系统。基工β3(序列为MGSSHHHHHHSSGLVPRGSDL YYLMDLSYSMKGGDLYYLMDLSYSMKGGDLYYLMDLSYSMKAS),分子量约为5.5KD。 用纤连蛋白(fibronectin,FN)作为细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM),研究多肽对肿瘤细胞与FN粘附的影响。结果发现:基工β3、化学合成的β3肽(简称化合β3)、化学合成的β2肽(简称化合β2)、化学合成的β1肽(简称化合β1)和GRGDS对HCCLM6细胞与FN粘附具有特异的抑制作用,呈现


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