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hTRAIL基因修饰成人骨髓基质干细胞靶向脑胶质瘤基因治疗的研究

吴惺  
【摘要】:恶性胶质瘤是原发性中枢神经系统肿瘤中最常见的一种肿瘤,它具有恶性级别进行性升高、高度浸润性的特点。胶质母细胞瘤是其中恶性度最高的,虽然显微神经外科技术、放射治疗及化疗水平的不断提高,但其首诊后的平均生存期仍仅为9-12个月。上世纪90年代初,基因治疗的热潮曾为恶性胶质瘤的治疗带来一线曙光,其中以HSV-TK/GCV系统为代表的基因治疗虽然在动物试验中都取得了良好的效果,然而在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验都未取得预期的疗效,这可能是由于病毒载体不稳定、目的基因不能长期表达、自体免疫、靶向性问题和病毒载体无法追踪浸润瘤细胞所致。骨髓干细胞(MSCs)能具有向肿瘤细胞迁徙的能力,而肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)具有特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用。基于以上基础,本研究将MSCs靶向肿瘤迁徙和TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞结合探索TRAIL修饰MSCs双重靶向治疗脑胶质瘤的可能。 首先我们采用利用1.073g/ml的Percoll梯度离心法,成功从成人骨髓中分离出单个核细胞,体外扩增成均一似成纤维细胞样细胞,其细胞表面CD105、CD166和CD44均为阳性,而CD11b、CD34和CD45均为阴性,在条件培养液下能分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。 为了进一步研究所获MSCs是否具有向胶质瘤细胞迁徙的能力,将AAV-GFP标记的MSCs悬液加入与U87MG共培养,荧光显微镜下可观察到绿色GFP阳性MSCs均聚积于U87MG胶质瘤细胞克隆中,在无胶质瘤细胞的区域也不见GFP阳性细胞。Transwell实验发现正常培养液和脑组织溶解物对MSCs的迁徙几乎无影响,而U87MG肿瘤溶解物、U87MG细胞培养液或U87MG肿瘤细胞能显著的诱导MSCs向其迁徙,。而上述刺激物对NIH3T3细胞的迁徙无明显差异。在U87MG脑胶质瘤模型建立1周后,将LacZ标记的MSCs静脉途径移植,发现脑肿瘤中则可也大量蓝色的LacZ均匀分布于其中。脑肿瘤内的LacZ阳性的MSCs(150.52±26.13/section)显著高于对侧正常脑组织(4.88±1.11/section)和其它器官(心脏:0/section;肺脏:3.54±1.56/section;肝脏:8.63±1.27/section;脾脏:4.67±1.73/section;肾脏:19.78±2.94/section)(P0.001)。种植于肿瘤对侧半球的MSCs大部分沿着白质纤维束如胼胝体向U87胶质瘤迁徙。 接着,我们从pROF-Trail质粒中获得全长TRAIL基因片段,并将其重组于


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