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SGT及其相关蛋白功能的研究

申海莲  
【摘要】:SGT(small glutamine-rich tetratricopeptiderepeat TPR)克隆于1998年,由313个氨基酸组成,其C末端有一段富含谷氨酰氨的序列,中间含有三个串联重复的TPR结构域。近年来的研究表明,SGT能够与热休克蛋白家族的Hsp70和Hsc70相互作用并调节其分子伴侣活性,而Hsp70和Hsc70的分子伴侣活性可以拮抗热休克、血清饥饿、化疗药物等引起的细胞凋亡,不仅如此,CHIP、TPR2、Strap这些含有TPR结构域的蛋白均以不同的方式参与了细胞凋亡的过程。为了弄清SGT是否也参与了细胞凋亡的过程,我们首先建立了SGT超表达的SMMC-7721稳转细胞株,用放线菌酮(CHX)处理稳转空载体的SMMC-7721和稳转SGT的SMMC-7721细胞后,分别用PI染色,AnnexinV和PI双染,DNA片段化降解检测,凋亡小体分析,Hoechest染色观察均证实SGT可以促进CHX诱导的7721细胞凋亡,进一步的研究表明这种促凋亡作用是Caspase依赖的,SGT可以促进Caspase家族蛋白的活化并将其底物PARP裂解,进一步的免疫荧光试验表明超表达SGT可使部分P53定位到线粒体。为了进一步探讨SGT的功能我们应用酵母双杂交的方法以SGT为诱饵筛选人胎肝cDNA文库鉴定出PIAS为它的一个新的结合蛋白,接下来用GST-pull down、免疫共沉淀,以及激光共聚焦的方法证实了二者在体内和体外均可相互作用。 β 1,4半乳糖基转移酶(GaIT Ⅰ)是一个最早克隆的糖基转移酶,长期以来被认为是一个管家基因,本实验室以前的工作表明GalT Ⅰ是SGT的一个相互作用蛋白,Ets转录因子家族的成员EIAF可调控其基因的转录。本文研究了Ets家族的另一成员Ets-1可否调控其转录。我们采用荧光素酶报告基因的方法证实Ets-1可激活GalT Ⅰ报告基因的表达,并具有量效关系。我们又采用突变分析法确定GaT Ⅰ启动子-215至-139核苷酸区域存在一个Ets-1的结合位点,进一步采用染色质免疫沉淀试验以及电泳凝胶迁移率改变试验证实Ets-1能够与此区域DNA直接结合,从而确定Ets-1是调控β 1,4半乳糖基转移酶基因的一个转录因子。


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