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EphrinB2与视网膜新生血管形成关系的实验研究

董道权  
【摘要】: 研究目的:探讨EphrinB2在视网膜新生血管形成中的作用及其机理,同时观察EphrinB2/Fc对实验性视网膜新生血管的干预效果。 研究方法:(1)选用出生后7天(postnatal day 7,P7)的C57BL/6J新生小鼠置入75%高氧环境5天,诱导产生视网膜新生血管(RNV)构建动物模型,另一组置入空气中饲养作为对照组。采用ADP酶视网膜染色铺片、视网膜组织切片光镜观察视网膜血管情况、酶标免疫组化检测ephrinB2的表达、RT—PCR测定其mRNA、Western blot分析其蛋白量的表达,探讨ephrinB2参与实验性RNV的病理过程。(2)实验性RNV小鼠一只眼采用ephrinB2/Fc 150ng/ul玻璃体注射,另一只眼注射等量PBS,观察ephrinB2/Fc对实验性RNV的干预效果。(3)选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察ephrinB2/Fc对细胞增殖以及其对VEGF165诱导的增殖的干预影响;采用细胞划线法、Transwell小室实验检测ephrinB2/Fc对细胞迁移以及VEGF165诱导的细胞迁移的影响;(4)采用Western blot分析ephrinB2/Fc对VEGF165诱导HUVEC增殖的影响以及VEGF165对内皮细胞ephrinB2蛋白表达调控。 研究结果:(1)P7 C57BL/6J小鼠放入高氧环境饲养5天后,返回空气中诱发出典型的实验性RNV改变,视网膜ADP酶染色铺片可见大片无灌注区及其边缘NV生长,视网膜光学切片可见大量视网膜前新生血管芽丛胞核,较之空气组P17小鼠其无血管区面积、视网膜前新生血管细胞核计数均有极显著性差异(p<0.0001)。酶标免疫组化检测结果显示实验性RNV上ephrinB2呈强阳性表达,而空气组为阴性。RT—PCR检测结果显示空气组小鼠P17视网膜ephrinB2的mRNA表达量明显少于高氧诱导组(p<0.0001)。Western blot检测显示,高氧诱导组P17小鼠ephrinB2的蛋白表达量明显高于空气组。(2)从视网膜无血管区、视网膜前细胞核计数、和ephrinB2的酶免组化检测的比较显示,ephrinB2/Fc150ng/ul对实验性RNV有显著的干预效果,与空气组和PBS空白对照组相比差异具有极显著性意义(p<0.0001)。(3)MTT法显示单纯ephrinB2/Fc对细胞增殖的抑制作用不明显,对VEGF165诱导的细胞增殖有明显的抑制作用,并随药物浓度的增加其抑制作用加强。细胞划线和Transwell小室实验显示ephrinB2/Fc对细胞的迁徙抑制作用随浓度的增高而加强(p<0.0001)。(4)HUVEC细胞经VEGF刺激后表达ephrinB2从2.5min开始上升,30min时开始下降,而经ephrinB2/Fc修饰后Western blot检测ephrinB_2表达不明显。 研究结论:(1)75%高氧诱导制备实验性RNV稳定可靠,ADP酶染色观察视网膜血管状况简洁实用,高氧诱导组P17小鼠视网膜呈典型的视网膜新生血管性病变,并可特异性的检测ephrinB2的免疫组化表达。其mRNA和蛋白表达均高于空气组。(2)与PBS空白对照组空气组相比,EphrinB2/Fc对实验性RNA具有显著的干预效果。(3)单纯应用ephrinB2/Fc对HUVEC细胞的增殖无明显影响,其对VEGF诱导的细胞增值有明显抑制作用,其效能随药物浓度增加而增强。(4)HUVEC经VEGF刺激后表达ephrinB2明显上升,ephrinB2/Fc和VEGF间可能存在相互调控的机制。


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