结核分枝杆菌脂肪酸代谢途径中相关酶和蛋白的分子生物学及三维结构的研究

【摘要】： 结核病作为全球性的健康问题，其发病率和死亡率呈逐年上升态势。分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是已经发现的最为重要的传染性病原体之一，它能够在宿主巨噬细胞中持续存活，每年引起八百万人感染，其中有三百万病人由于得不到合理的治疗而死亡。此外，在过去40年以来，一直没有开发出治疗效果比异烟肼更优的药物。而多耐药菌株(Muti-drug resistant，MDR)的出现和广泛传播，以及与艾滋病的共同作用，使得结核病的疫情进一步恶化。开发更有效、更快速的抗结核新药，彻底攻克结核病已势在必行。 结核杆菌的基因组含4000多个基因，其中有250个基因编码脂肪酸代谢相关的酶，和大肠杆菌相比多了4倍有余。结核杆菌的细胞壁以肽聚糖为基本架构，共价结合阿拉伯半乳糖及分支菌酸。分支菌酸是自然界中最大的脂肪酸，它和结核杆菌的毒力、结核杆菌逃逸免疫系统攻击的能力息息相关。另外，细胞壁所含的脂类约占细胞壁干重的60％等等，这些事实均说明了脂肪酸代谢对结核杆菌的重要性。丙二酰CoA：ACP转化酶(Malony-CoA：ACP transacylase，MCAT)是脂肪酸代谢中的一个关键酶，催化Malonyl-CoA形成Malonyl-ACP，后者进入脂肪酸碳链延长循环，每次增加2个碳原子。ACP(Acyl carrier protein)是FASⅡ系统中的小且酸性的蛋白，它在脂肪酸代谢中起着重要作用，与大分子脂肪酸的合成及结核细胞壁的装配紧密相关。ACP与MCAT都是很好的抗结核药物靶位的候选对象。 本论文共克隆、表达、纯化了结核杆菌的两个MCAT和三个可能的ACP蛋白，并检测了这些蛋白的一些生理生化功能及特性。在酶活测定中，我们了解到FabD和FabD_2的性能相近，几种二价阳离子对酶活的影响不大；Rv1344转录的蛋白确实具有载酰功能，而Rv0033可能在别的通路中发挥作用。RT-PCR试验阐明了两个MCAT蛋白在结核杆菌侵入巨噬细胞后的转录情况，其中FabD的表达上调，而FabD_2表达量减少，证实了结核杆菌两个MCAT蛋白在结核病急性及持续感染中的重要性。通过Western检测，耐药菌株感染的病人血清和敏感株病人血清中都具有Acp1344的抗原，说明了Acp1344的重要性及它作为结核诊断的辅助指标的可能。此外，我们还通过Rv1344基因的定点突变试验，验证了Acp1344蛋白中一些序列的重要性与保守性。 圆二色谱的测定，使我们得到了几种蛋白的二级结构。为了获得这些蛋白的三维结构，设计出活性小分子化合物，我们还与清华大学结构生物学实验室合作，对这些蛋白进行了晶体生长的尝试性实验。最终得到两个MCAT的晶体，其中FabD的分辨率在2(?)，而FabD_2晶体的分辨率只有6(?)。最后，我们解析出FabD蛋白的晶体结构。虽然未能得到Acp1344的晶体结构，我们仍用同源模建的方法，得到了该蛋白模拟的三维结构，为设计有活性的小分子化合物打下良好基础。