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OLETF自发性糖尿病大鼠心肌病变及其瘦素与胰岛素信号通路变化的研究

周丽诺  
【摘要】: 第一部分OLETF自发性糖尿病大鼠模型与心肌病变 糖尿病心肌病是独立于高血压、冠心病和其它种类的心脏病之外的特异的心脏病变,但由于缺乏特异的检查方法和病理取材的困难,临床研究具有较大难度,由于2型糖尿病发病率逐年上升,对2型糖尿病心肌病变的研究尤为重要。本研究目的在于建立一个大鼠2型糖尿病伴心肌病变的模型。 本研究选择了类似人类2型糖尿病的OLETF糖尿病大鼠模型,经较长发间的观察和培养,并利用组织形态学(超薄切片透射电子显微镜)和功能检查(葡萄糖耐量试验、生理记录仪心功能检查)等,详细了解了该模型的特点,病情演变过程,心肌病变的存在及超微结构的特征,证实了该种自发性糖尿病大鼠模型具有2型糖尿病相应的特点:1)晚发高血糖;2)糖尿病病程长;3)轻度肥胖;4)血脂异常;5)有肾脏并发症(结节性病变)等。 该模型同时存在着多种心肌病变表现,表现如下:在鼠龄24周的糖尿病形成初期,心肌发现的主要病理改变为毛细血管内皮肿胀、管腔折叠,心肌中圆形和类圆形白色脂肪滴显著增多,散在于肌原纤维间,轻度的间质胶原沉积;70周的晚期,糖尿病肾脏病变明显存在时,心肌毛细血管基膜明显增厚,形成向管腔内的突起,线粒体融合、漂浮、变性外逸,结构不清,心肌细胞内多处出现脂褐素等老化现象,大量胶原纤维在间质内沉积,心室肌细胞挛缩、收缩坏死带形成,伴有舒张功能的减退,但未见冠状动脉病变,血压基本正常。 第二部分OLETF自发性糖尿病大鼠模型心肌胰岛素信号通路成分改变-糖尿病心脏基因芯片差异表达分析 糖尿病心肌病的发病机制是复杂的,而基因芯片技术可以在短时间内探测到在特定状态下,发生差异表达的众多基因。为了比较自发性糖尿病大鼠和正常大鼠心肌组织中基因表达的差异,探讨糖尿病性心肌病的发病机制,本研究采用3只OLETF糖尿病大鼠的心肌组织作为试验组,3只LETO大鼠心肌组织为对照组,鼠龄均为70周,采用汇合标本,使用Affymetrix公司的基因芯片进行检测。步骤为从心肌组织中抽提纯化总RNA,经逆转录合成两组动物的cDNA及cRNA探针;cRNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用GCOS软件进行分析统计。并采用RT-PCR验证了2个差异表达的胰岛素信号通路成分基因。 结果:检测基因3万多个,其中上调基因102个,下调基因103个。其中已知基因有明确意义者为:1)病程较长的OLEFT大鼠心肌胰岛素信号通路的关键分子存在异常,表现为PI-3K P85亚基基因显著表达减少达8倍之多,以及IRS—1 mRNA表达下降;2)参与糖酵解的磷酸丙酮酸烯醇化酶,参与酮体生成的HMG-CoA裂合酶、蛋白质降解的泛素激活酶以及其他参与蛋白质转运代谢的可溶性载体家族3成员1在糖尿病心肌中的表达量均明显降低2倍以上。肌球蛋白是一种具有ATP酶活性,可与钙离子结合,参与肌丝运动,平滑肌收缩的蛋白质,在糖尿病心肌中的表达量也是明显降低的;3)基因分析结果还表明,在OLEFT大鼠中,促进细胞增殖、分化,血管增生的相关基因明显上调表达。Kruppel-like factor 5基因是细胞增殖的正调控转录因子,当受血管紧张素Ⅱ刺激时,可结合PDGF-A导致心肌肥厚。它同表皮生长因子一样可以激活MEK通路促进细胞分化、增殖,调节平滑肌表型,促进血管生成。而血管生成素样蛋白4,谷氨酰氨基肽酶和富含半胱氨酸蛋白61、磷脂酶A2、整联蛋白α1都有诱导细胞增殖、介导血管生成、促进细胞黏附、趋化、迁移的作用。以上这些基因均明显2倍以上上调表达。 第三部分OLETF自发性糖尿病大鼠模型心肌瘦素JAK2/IRS-2/PI-3K与胰岛素IRS-1/PI-3K信号通路变化的研究 肥胖的2型糖尿病经常存在高胰岛素血症和高瘦素血症,心脏不但存在胰岛素受体,也存在数种瘦素受体亚型。因此推测两种激素可能会相互修饰各自的作用,即这两种激素的信号系统可能存在交叉,正如在胰腺、肝脏等脏器发现的那样。为了明确这一点,我们在类似人类2型糖尿病的轻度肥胖的OLETF糖尿病大鼠中对瘦素和胰岛素的相互作用进行了初步的探讨。方法上采用了主动脉逆行插管灌注分离培养OLETF糖尿病大鼠心肌细胞,并分别鉴定了心肌细胞上存在的瘦素的长型和短型受体,应用western-blot方法检测体外培养心肌细胞在应用胰岛素和瘦素刺激及胰岛素信号通路PI-3K抑制剂和瘦素信号通路JAK2抑制剂AG490后心肌细胞膜GLUT4含量。结果:1)胰岛素、瘦素及二者的联合刺激LETO大鼠心肌细胞可能通过使GLUT4基因表达增多或转位增加的方式,使心肌细胞膜GLUT4蛋白含量增加。但上述激素刺激对OLETF糖尿病大鼠心肌细胞膜GLUT4蛋白含量升高的作用不如LETO大鼠;2)PI-3K抑制剂LY294002预处理30分钟对胰岛素、瘦素及二者的联合刺激诱导的LETO大鼠和胰岛素刺激的OLETF糖尿病大鼠和心肌细胞膜GLUT4蛋白含量均有抑制效应,但对瘦素和瘦素加胰岛素刺激的OLETF糖尿病大鼠心肌细胞膜GLUT4蛋白含量无明显作用;3)JAK2抑制剂AG490预处理30分钟可使LETO瘦素组心肌细胞膜葡萄糖GLUT4蛋白含量明显下降,而对LETO其它组和OLETF糖尿病大鼠各刺激组心肌细胞膜GLUT4蛋白含量均无抑制效应,表明:OLETF糖尿病大鼠胰岛素信号通路和与胰岛素交叉的瘦素信号通路均可能存在原发受损。 结论 1)初步鉴定了大鼠2型糖尿病伴心肌病变模型:特征:①具有2型糖尿病特征;②无高血压;③轻度心脏舒张功能受损;④显著心脏病理改变,纤维化和微血管病变;⑤未见冠状动脉病变。 2)成功建立了OLEFT糖尿病大鼠和对照LETO大鼠的心肌培养模型,活力达到实验要求。 3)证实了在STZ、OLETF糖尿病大鼠及SD、LETO对照鼠心肌中分别存在瘦素短型和长型受体,并且定位于心肌细胞膜上。 4)基因芯片结果显示:①鼠龄较大的OLEFT糖尿病大鼠心肌胰岛素信号通路的关键分子存在异常,表现为PI-3K P85亚基基因显著表达减少达8倍之多和IRS—1 mRNA表达下降,提示胰岛素抵抗可能存在于心肌,而且,OLEFT肥胖糖尿病大鼠心肌胰岛素抵抗的部位可能主要在PI-3K。②参与糖酵解、脂代谢、蛋白代谢和心肌收缩蛋白的相关基因的下调,提示糖尿病心肌的代谢紊乱。而细胞增殖、分化,血管增生的有关基因上调表达,与糖尿病心肌病理改变可能有密切联系。 5)在OLETF糖尿病大鼠及LETO对照鼠的心肌细胞中可能存在胰岛素IRS-1/PI-3K和瘦素JAK2/IRS-2/PI-3K信号通路,这两条通路可能促使GLUT4基因表达或转位。并可能存在交叉。瘦素可能通过与胰岛素信号通路的交叉,部分模拟胰岛素对GLUT4的作用。PI-3K抑制剂LY294002和JAK2抑制剂AG490可能通过阻断胰岛素和瘦素的信号通路,影响GLUT4基因的表达或GLUT4的转位,对心肌葡萄糖代谢产生不利作用。


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