线粒体ATP敏感的钾通道开放对大鼠肺移植术后缺血再灌注损伤的作用研究

【摘要】： 第一部分显微镜辅助下单人操作建立大鼠左单肺原位同种异体移植模型 目的：建立大鼠原位同种异体左单肺移植模型，为肺保存、肺缺血再灌注损伤(IRI)的研究提供动物实验模型。 方法：32只SD雄性大鼠随机配对成16对，分成2个时间点(2h和24h)，每个时间点8对(n=8)，平均体重为257.5±23.7g(230～300g)，采用三“袖套”管法单人操作成功建立大鼠原位同种异体左单肺移植模型，完成16例左肺原位移植。测定右颈动脉的血气分析，并同时测定左肺静脉的血气分析来了解移植肺肺功能。 结果：16例大鼠左肺原位移植，失败4例，成功率75.0％。术后再灌注2h右颈动脉的PaO_2和左肺静脉PaO_2有显著性差异(222.14±29.43mmHg vs 146.71±35.35mmHg，P=0.001)，24h右颈动脉的PaO_2和左肺静脉PaO_2有显著性差异(217.20±32.59mmHg vs 109.80±22.29mmHg，P＜0.001)。术后再灌注2h、24h右颈动脉的PaCO_2和左肺静脉的PaCO_2差异无统计学意义，(P＞0.05)。 结论：利用自制的供肺固定装置进行供肺套管置入以及受体简单的缝合三针牵引暴露进行受体套接吻合建立大鼠肺移植模型，容易复制。肺移植术后动物模型生理状态稳定，能够应用于肺保存、肺IRI保护的实验研究。 第二部分线粒体ATP敏感的钾通道开放对大鼠肺移植术后缺血再灌注损伤的保护作用 目的：研究线粒体ATP敏感的钾通道(mitoKATP)开放对大鼠肺移植术后IRI是否具有保护作用，为临床治疗肺移植术后肺IRI提供实验基础和理论依据，寻求一条可能的药物治疗途径。 方法：采用第一部分大鼠左单肺同种异体原位移植方法建立动物模型。SD雄性大鼠120只，随机配对成60对，分成5组，每组12对，分别为假手术组(S组)：行左开胸术，但不行移植，从开胸至关胸时间控制于90min；生理盐水对照组(C组)：单纯行左肺原位移植并再灌注，术前给予0.5ml的生理盐水腹腔注射；溶剂DMSO对照组(DMSO组)：移植术前给予同等剂量溶剂DMSO腹腔注射；二氮嗪实验组(DA组)：移植术前30min大鼠腹腔注射给予二氮嗪5mg／kg，加生理盐水至0.5ml腹腔注射；5-羟基葵酸盐复合二氮嗪组(HD-DA组)：移植术前45min给予5-HD腹腔注射，5mg／kg，15min后腹腔注射二氮嗪5mg／kg，30min后移植；再灌注后每组取两个时间点(2h和24h)，每个时间点为6对(n=6)，分别检测各时间点的右颈动脉及左肺静脉血气分析、肺组织湿干重比(W／D)、血清和肺组织丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、ELISA定量检测血清和肺组织肿瘤坏死因子-a(TNF-a)及白介素-6(IL-6)、肺组织病理学检查和超微电镜检查以及TUNEL法检测肺细胞凋亡。 结果： 1．DA组2h左肺静脉PaO_2和C组相比差异有显著性(226.0±30.4 vs 152.8±41.9mmHg，P=0.009)，24h左肺静脉PaO_2和C组相比差异有显著性(206.2±36.4 vs 106.5±25.5，P＜0.001)，24h的右颈动脉PaO_2和C组相比有显著性差异(277.7±37.0 vs 210.2±37.3，P=0.008)。给予阻断剂后HD-DA组2h左肺静脉PaO_2和DA组相比差异有显著性(154.8±46.1 vs 226.0±30.4，P=0.011)，24h左肺静脉PaO_2和DA组相比差异有显著性(111.5±23.2 vs 206.24±36.4，P＜0.001)。 2．DA组和C组再灌注2h左肺W／D比较无显著性差异(5.44±0.32 vs 5.69±0.25，P=0.092)，再灌注24h后DA组和C组左肺比较有显著性差异(5.86±0.20 vs 6.72±0.34，P＜0.001)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h左肺W／D比较无显著性差异(5.72±0.20 vs 5.44±0.32，P=0.062)，再灌注24h后左肺HD-DA组和DA组比较有显著性差异(6.65±0.26 vs 5.86±0.20，P＜0.001)。 3．光镜观察S组未见明显异常。DA组和C组再灌注2h病理评分比较无显著性差异(4.50±1.00 vs 5.69±0.25，P=1.000)，再灌注24h后DA组和C组比较也无显著性差异(6.08±0.74 vs 10.58±1.36，P=1.000)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h病理评分比较无显著性差异(7.00±0.55 vs 4.50±1.00，P=1.000)，24h后HD-DA组和DA组比较无显著性差异(10.33±0.82 vs 6.08±0.74，P=1.000)。HE染色C组、HD-DA组可见充血、水肿、白细胞浸润、渗出，DA组较C组、HD-DA组水肿、充血减轻。电镜观察C组、HD-DA组再灌注2h和24h后可见各型细胞线粒体肿胀、嵴断裂，Ⅰ、Ⅱ型细胞浆空泡化、线粒体膜破坏等，DA组各型细胞损伤较C组、HD-DA组轻。 4．DA组MDA和C组再灌注2h血清和血清比较、肺组织和肺组织比较有显著性差异(2.46±0.46 vs 8.41±0.91nmol／ml，0.77±0.07 vs 2.72±0.37nmol／mgprot，P＜0.001)，24h后DA组和C组比较有湿著性差异(2.57±0.45 vs 5.80±1.07，P＜0.001，0.92±0.12 vs 1.27±0.20，P=0.001)。阻断后HD-DA组MDA和DA组再灌注2h血清和血清比较、肺组织和肺组织比较有显著性差异(8.72±0.67 vs 2.46±0.46，2.98±0.41 vs 0.77±0.07，P＜0.001)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(6.21±0.83 vs 2.57±0.45，P＜0.001，1.26±0.21 vs 0.92±0.12，P=0.001)。 DA组和C组再灌注2h肺MPO活性比较有显著性差异(3.45±0.37 vs 5.52±0.71单位／克湿片，P＜0.001)，24h后DA组和C组比较有显著性差异(3.50±0.35 vs 7.92±0.48，P＜0.001)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h肺MPO活性比较有显著性差异(5.46±0.56 vs 3.45±0.37，P＜0.001)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(7.81±0.41 vs 3.50±0.35，P＜0.001)。 DA组T-AOC和C组再灌注2h血清和血清比较、肺组织和肺组织比较有显著性差异(20.98±2.32 vs 9.49±1.57U／ml，2.36±0.32 vs 1.45±0.25U／mgprot，P＜0.001)，24h后DA组和C组比较有显著性差异(18.43±1.51 vs 8.10±1.89，2.19±0.21 vs 1.32±0.18，P＜0.001)。阻断后HD-DA组T-AOC和DA组再灌注2h血清和血清比较、肺组织和肺组织比较有显著性差异(9.48±1.57 vs 20.98±2.32，1.32±0.20 vs 2.36±0.32，P＜0.001)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(7.60±1.39 vs 18.43±1.51，1.13±0.19 vs 2.19±0.21，P＜0.001)。 5．各组间的血清细胞因子同一时间点比较无显著性意义。DA组和C组再灌注2h肺组织TNF-a比较有显著性差异(4.03±0.51 vs 12.68±0.94ng／mgprot，P＜0.001)，24h后DA组和C组比较有显著性差异(4.14±0.57 vs 6.18±1.38，P=0.001)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h肺组织TNF-a比较有显著性差异(11.89±0.80 vs 4.03±0.51，P＜0.001)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(6.02±0.54 vs 4.14±0.57，P=0.002)。DA组和C组再灌注2h肺组织IL-6比较有显著性差异(7.09±0.66 vs 19.92±2.66ng／mgprot，P＜0.001)，24h后DA组和C组比较有显著性差异(6.64±0.63 vs 11.21±1.20，P＜0.001)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h肺组织IL-6比较有显著性差异(20.41±2.46 vs 7.09±0.66，P＜0.001)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(11.20±0.87 vs 6.64±0.63，P＜0.001)。 6．DA组和C组再灌注2h肺组织细胞凋亡指数(AI)比较有显著性差异(2.40±0.61 vs 13.20±0.93，P＜0.001)，24h后DA组和C组比较无显著性差异(2.27±0.62 vs 3.27±0.45，P=0.065)。给予阻断剂后HD-DA组和DA组再灌注2h肺组织细胞AI比较有显著性差异(12.67±1.07 vs 2.40±0.61，P＜0.001)，24h后HD-DA组和DA组比较无显著性差异(2.83±0.61 vs 2.27±0.62，P=0.131)。 结论： 1．MitoKATP的开放剂二氮嗪的应用能改善移植肺IRI后氧合功能的下降。 2．MitoKATP开放对于再灌注后毛细血管通透性的改善作用不十分明显，病理评分来见有显著提高，但形态学直接观察可见损伤减轻。 3．MitoKATP的开放能减轻组织的脂质过氧化反应、抑制IRI时肺组织中性粒细胞(PMN)的聚集，提高机体的总抗氧化能力，提示mitoKATP的开放可以对肺IRI具有一定的保护作用。 4．在肺IRI中细胞因子的旁分泌、自分泌活性在肺IRI起着重要作用。mitoKATP的开放抑制细胞炎症因子的分泌并减轻炎症的级联反应，进而防止肺移植术后IRI。 5．本实验观察到肺IRI细胞凋亡是一个早期事件。MitoKATP的开放能抑制2h时肺IRI的细胞凋亡。 第三部分NF-κB及TNF-a mRNA、IL-6 mRNA在大鼠肺移植术后IRI中的作用机制以及和mitoKATP开放的关系探讨 目的：研究mitoKATP开放对大鼠肺移植术后肺组织TNF-a mRNA、IL-6 mRNA的影响以及核转录因子kappa B(NF-κB)的活性变化，探讨其在IRI中可能的作用机制。 方法：动物模型和实验分组设计同第二部分，采用实时定量PCR(Real Time PCR)进行肺组织TNF-a mRNA、IL-6 mRNA表达量的相对定量。ELISA检测NF-κB的活性。 结果： 1．DA组和C组再灌注2h肺组织TNF-a mRNA比较有显著性差异(17.00±1.50 E-5 vs 30.82±1.37 E-5，P＜0.05)，24h后DA组和C组比较有显著性差异(4.34±0.79 E-5 vs 8.13±0.95 E-5，P＜0.05)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h肺组织TNF-a mRNA比较有显著性差异(28.75±1.96 E-5 vs 11.89±0.80 E-5，P＜0.05)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(8.30±0.74 E-5 vs 6.02±0.54 E-5 P＜0.05)。 2．DA组和C组再灌注2h肺组织IL-6比较有显著性差异(0.052±0.007 vs 0.138±0.015，P＜0.05)，24h后DA组和C组比较无显著性差异(0.036±0.003 vs 0.041±0.005，P＞0.05)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h肺组织IL-6比较有显著性差异(0.151±0.009 vs 0.052±0.007，P＜0.05)，24h后HD-DA组和DA组比较无显著性差异(0.042±0.005 vs 0.036±0.003，P＞0.05)。 3．DA组和C组再灌注2h肺NF-κB活性比较有显著性差异(0.49±0.08 vs 1.84±0.20，P＜0.05)，24h后DA组和C组比较有显著性差异(0.51±0.09 vs 1.08±0.17，P＜0.05)。阻断后HD-DA组和DA组再灌注2h肺NF-κB活性比较有显著性差异(1.93±0.13 vs 0.49±0.08，P＜0.05)，24h后HD-DA组和DA组比较有显著性差异(1.11±0.18 vs 0.51±0.09，P＜0.05)。 结论： 1．再灌注后NF-κB活性显著升高，提示IR能引起NF-κB活性变化。MitoKATP开放后NF-κB活性有显著下降，并能被5-HD阻断，提示mitoKATP开放能抑制NF-κB的活化。 2．再灌注后不同时间点各组的TNF-a mRNA升高明显，和TNF-a蛋白水平相一致，提示和NF-κB的活化相关。mitoKATP开放后TNF-a mRNA下降明显，但和蛋白水平的TNF-a完全阻断不一致。mitoKATP开放能通过抑制NF-κB启动而影响TNF-a mRNA，但可能还有其他因素影响其转录。 3．IL-6 mRNA再灌注2h后升高明显，与前一章节中IL-6蛋白水平相一致，和NF-κB的活化相关，mitoKATP开放后2h的IL-6 mRNA下降明显，提示其作用可能通过抑制NF-κB启动而影响IL-6 mRNA。但24h看不到再灌注后IL-6mRNA的明显变化，和蛋白水平不符，和NF-κB的活化无明显关系。