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用蛋白质组学和RNA干扰技术研究滋养细胞缺氧与子痫前期发病的关系

胡蓉  
【摘要】:子痫前期是妊娠期常见病,是引起孕产妇和胎儿死亡的主要原因之一。经过国内外科学家的多年努力,目前病因和发病机制仍然不明。近年来,滋养细胞缺氧与子痫前期发病的关系日益受到重视,但目前缺氧对滋养细胞损伤的分子机制了解甚少,因此根据我们所掌握的知识尚不能很好地解释滋养细胞缺氧导致子痫前期发病的分子机制。本研究中,首先研究了缺氧对细胞滋养细胞凋亡的影响。在此基础上,用蛋白质组技术研究了缺氧对滋养细胞形成合体滋养细胞过程中蛋白质组表达的影响,以及子痫前期胎盘与正常妊娠胎盘蛋白质组表达的差异,并分析子痫前期胎盘组织的蛋白质组表达和缺氧培养滋养细胞的蛋白质组表达之间的相似性和差异性,从而发现与滋养细胞缺氧导致子痫前期发病有关的蛋白质。并进一步用RNA干扰(RNAi)技术初步研究了蛋白质组技术筛选出的表达有差异的蛋白质的功能。旨在研究缺氧对滋养细胞生物学行为、蛋白质组表达以及关键蛋白功能的影响,并探讨滋养细胞缺氧与子痫前期发病的关系。 第一部分 缺氧促进妊娠早期细胞滋养细胞凋亡伴Bcl-2和Bax蛋白表达变化 目的:研究缺氧对妊娠早期细胞滋养细胞凋亡以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。 方法:原代培养的妊娠早期细胞滋养细胞分别在正常氧或缺氧条件下培养,用DNA ladder、流式TUNEL和Annexin V法检测细胞凋亡,用Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。 结果:与正常氧培养相比,缺氧培养使滋养细胞出现凋亡特征性的电泳DNAladder,同时流式TUNEL法和Annexin V法检测均发现细胞凋亡率增加(p<0.05),并伴有Bcl-2蛋白表达减少和Bax蛋白表达增加(p<0.05)。 结论:缺氧促进妊娠早期细胞滋养细胞凋亡,并伴随Bcl-2和Bax蛋白表达变化。更多研究有助于进一步了解缺氧导致细胞滋养细胞凋亡增加在子痫前期发病中的作用。 第二部分 用蛋白质组学技术研究滋养细胞缺氧与子痫前期发病的关系 第一节 缺氧影响合体滋养细胞形成的差异蛋白质组分析 目的:用比较蛋白质组学的方法,研究缺氧使BeWo细胞形成合体滋养细胞过程中蛋白质组表达的变化,发现缺氧抑制合体滋养细胞形成中起调控作用的蛋白并探讨可能的机制。 方法:Forskolin诱导BeWo细胞在正常和缺氧条件下分化成合体滋养细胞。提取细胞总蛋白用双向凝胶电泳分离、银染显色,凝胶图像分析找到表达有差异的蛋白点;将差异蛋白点酶解、提取肽段后用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)进行鉴定。并对有重要意义的蛋白用Western blot方法验证。 结果:(1)缺氧抑制Forskolin诱导的BeWo细胞分化成合体滋养细胞。(2)与正常培养相比,缺氧使BeWo细胞形成合体滋养细胞过程中,20种蛋白表达发生变化,其中7种蛋白表达下调,13种蛋白表达上调。其中三种抗氧化剂蛋白(peroxiredoxin1,peroxiredoxin2和1-Cys peroxiredoxin)表达降低;参与糖酵解的酶(malate dehydrogenase和enolase)表达增加;annexin家族蛋白(annexin A2和annexin A5)表达增加;信号传导分子14-3-3τ蛋白表达减少;细胞骨架蛋白(keratin1和β-actin)表达下调;凋亡相关蛋白galectin-3表达上调;一些参与细胞内蛋白降解和折叠调节的蛋白表达也发生变化。这20种蛋白参与细胞内多种生物活动,包括调节细胞氧化应激状态、糖酵解、细胞信号传导、细胞骨架构成和细胞迁移、运动等。(3)Western blot验证了缺氧使BeWo细胞peroxiredoxin1和14-3-3τ蛋白表达下调,annexin A5和annexin A2蛋白表达上调。 结论:运用蛋白质组学技术分析缺氧时滋养细胞蛋白表达的变化,为研究滋养细胞缺氧反应性蛋白提供新的视角,有助于了解缺氧影响合体滋养细胞形成的分子机制。更多研究有助进一步了解滋养细胞缺氧时表达发生变化的蛋白与子痫前期发病的关系。 第二节 子痫前期胎盘组织的差异蛋白质组分析 目的:通过子痫前期患者胎盘组织与正常妊娠胎盘组织的比较蛋白质组学的研究,寻找与子痫前期发病相关的蛋白,为阐明该病的发病机制提供依据。 方法:取正常妊娠和子痫前期胎盘组织(n=8),同时用总蛋白提取法和顺序提取 法提取蛋白。蛋白用双向凝胶电泳分离、银染显色;凝胶图像分析找到表达有差异的蛋白点;将差异蛋白点酶解、提取肽段后用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)进行鉴定。并对有重要意义的差异蛋白用Western blot进行验证。 结果:(1)比较正常妊娠和子痫前期胎盘组织蛋白质组图谱发现,两组表达模式相似,13种蛋白表达量发生变化,其中3种蛋白表达下调,10种蛋白表达上调。3种表达下调的蛋白包括:titin、内质网膜蛋白(calnexin)和一种未知蛋白。10种表达上调的蛋白包括:热休克蛋白27、葡萄糖调节蛋白78、prohibitin、annexin A1、NADH-泛醌氧化酶复合体、actin、keratin 10、中心粒(Centrosome)、chloride intracellular channel protein3和smooth muscle and non-muscle myosin。(2)Western blot验证了子痫前期胎盘组织热休克蛋白27表达上调。 结论:运用蛋白质组技术了解子痫前期胎盘蛋白表达的变化,为我们研究该病的发病机制提供新思路,进一步研究这些蛋白可能发现子痫前期发病的关键蛋白质。 第三部分 用RNA干扰技术研究差异蛋白在缺氧影响滋养细胞中的作用 第一节 14-3-3τ在缺氧抑制合体滋养细胞形成中的作用 目的:本论文第二部分用比较蛋白质组学的方法,发现缺氧使BeWo细胞14-3-3τ蛋白表达降低,本部分进一步研究14-3-3τ在BeWo细胞分化成合体滋养细胞以及缺氧抑制BeWo细胞形成合体滋养细胞中的作用。 方法:BeWo细胞转染14-3-3τ siRNA或control siRNA后,分别在正常氧或缺氧条件下培养。Real time PCR检测14-3-3τ mRNA的表达。Western blot检测14-3-3τ蛋白的表达。14-3-3τ RNAi的效果用14-3-3τ mRNA和蛋白表达的变化来评估。用融合的细胞占细胞总数的比率以及培养液中hCG浓度来比较合体滋养细胞形成率。 结果:(1)与DMSO作用组(对照组)相比,forskolin作用使BeWo细胞分化成合体滋养细胞增加,伴14-3-3τ表达增加(p<0.05)。(2)与正常氧培养相比,缺氧抑制BeWo细胞形成合体滋养细胞,伴14-3-3τ表达减少(p<0.05)。(3)BeWo细胞转染14-3-3τ siRNA后,14-3-3τ mRNA和蛋白表达减少(p<0.05),control siRNA转染对14-3-3τ表达无影响。(4)14-3-3τ siRNA转染使BeWo细胞形成合体滋养细胞减少(p<0.05),control siRNA转染对合体滋养细胞形成无影响。 结论:14-3-3τ参与合体滋养细胞形成的调节,也是缺氧抑制合体滋养细胞形成过 程中的一个重要调控因子。 第二节 HIF-1α对抗缺氧诱导的细胞滋养细胞凋亡 目的:研究RNA干扰技术下调HIF-1α的表达对缺氧诱导BeWo细胞凋亡的影响。 方法:BeWo细胞转染HIF-1α siRNA或control siRNA后,分别在正常氧或缺氧条件下培养。Real time PCR检测HIF-1α mRNA的表达。Western blot检测HIF-1α、Bcl-2和Bax蛋白的表达。HIF-1α RNAi的效果用HIF-1α mRNA和蛋白表达的变化来评估。流式TUNEL法检测细胞凋亡。 结果:(1)与正常氧培养相比,缺氧培养24h后,BeWo细胞凋亡增加,HIF-1α表达增加,并伴随Bcl-2蛋白表达减少和Bax蛋白表达增加(p<0.05)。(2)BeWo细胞转染HIF-1α siRNA后,HIF-1α mRNA和蛋白均表达减少(p<0.05),control siRNA转染对HIF-1α表达无影响。(3)HIF-1α siRNA转染使BeWo细胞凋亡显著增加,并伴有Bcl-2蛋白表达减少和Bax蛋白表达增加(p<0.05),control siRNA转染对细胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白表达无影响。 结论:在缺氧诱导BeWo细胞凋亡时,HIF-1α是抗凋亡因子,并可能通过Bcl-2家族蛋白发挥作用。


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