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散发性结直肠癌的β-Catenin基因突变及表达和单细胞拉曼光谱研究

覃业军  
【摘要】: 目的:(1)观察β-Catenin基因在散发性结直肠癌(SCRC)中胞浆胞核异常表达特征及突变发生率并探讨其临床病理相关性;(2)检测SCRC标本的微卫星不稳定(MSI)状态,分析其与β-Catenin基因突变的关系;(3)检测SCRC组织及癌旁正常粘膜中β-Catenin mRNA的含量,探讨其与SCRC中的β-Catenin蛋白异常表达以及临床病理学指标间的关系;(4)检测SCRC单细胞的拉曼光谱,以便建立区分癌细胞和正常细胞的诊断识别模型并分析生化改变。 方法:(1)用免疫组织化学EnVision二步法检测了90例SCRC和22例散发性结直肠腺瘤标本的β-Catenin基因在胞浆胞核中的异常表达。(2)以PCR扩增和直接测序检测了上述标本中β-Catenin基因第3外显子突变。(3)用PCR扩增和毛细管电泳检测Bat25和Bat26两个微卫星位点。(4)用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测了81例SCRC组织和28例癌旁正常粘膜组织的β-CateninmRNA含量。(5)应用光镊拉曼光谱技术(LTRS)检测10例SCRC的单细胞和正常粘膜上皮单细胞的拉曼光谱,经主元分析和逻辑回归分析建立诊断识别模型。 结果:(1)正常结直肠粘膜中β-Catenin表达定位于细胞膜上,未见胞浆胞核的异常表达。散发性结直肠腺瘤和腺癌组织出现胞浆和胞核的异常表达,膜表达有不同程度的降低。在SCRC中β-Catenin的胞浆和胞核表达率(分别为88.9%和41.1%)显著高于散发性结直肠腺瘤(分别为59.1%和18.2%)(P<0.05)。SCRC的β-Catenin异常胞浆表达与肿瘤生长方式、分化程度相关,阳性表达率在溃疡型和浸润型生长、高中分化腺癌分别高于隆起型生长、低分化腺癌(P<0.05)。SCRC的β-Catenin核表达率在浸润型和溃疡型生长(50.0%)高于在隆起型生长(26.5%)(P<0.05)。核表达多为灶性分布,主要在肿瘤浸润前沿呈阳性表达。(2)90例SCRC标本中仅有1例在β-Catenin第3外显子发生点突变,为杂合性突变,即41密码子ACC→GCC,苏氨酸变成丙氨酸,突变率约1%。22例散发性腺瘤未发现第3外显子突变。(3)90例SCRC标本中有8例表现高度微卫星不稳定(MSI-H),发生率为9%(8/90),其中一例为β-Catenin突变,而微卫星稳定(MSS)病例中未检测到突变。(4)在散发性结直肠癌组织中β-Catenin mRNA含量(2.5267±2.2839)低于癌旁正常粘膜组织中的含量(5.0029±3.3264),差别有显著性意义。淋巴结转移组的β-Catenin mRNA含量(1.8266±1.2883)低于淋巴结无转移组(3.3592±2.8805),P<0.05;溃疡型和浸润型生长组β-Catenin mRNA含量(2.2023±2.0351)低于隆起型生长组(3.1083±2.6103),P<0.05;在β-Catenin胞浆或胞核异常表达组和无胞浆或胞核异常表达组织之间,β-Catenin mRNA含量的差别无显著性意义。(5)我们建立了区分散发性结直肠癌细胞和正常细胞的诊断识别模型,其诊断识别的敏感度和特异度分别达到92.5%和82.5%。光谱分析结果显示,癌细胞中核酸和蛋白质水平高于正常细胞,而脂质含量低于正常细胞。 结论: 1.在SCRC中β-Catenin胞浆及核内异常表达率达率分别为88.9%和41.1%,其胞浆胞核异常表达率只与结直肠癌的发生阶段、生长方式及分化程度相关。β-Catenin胞核异常表达往往出现在肿瘤的浸润前沿,可能与癌肿的侵袭行为有关。 2.在SCRC中β-Catenin突变率很低,推测在SCRC中β-Catenin突变不是β-Catenin胞浆胞核异常表达的主要原因;伴MSI-H的SCRC可能易发生β-Catenin突变。 3.在SCRC中β-Catenin mRNA的含量显著低于正常结直肠粘膜中的含量,可能是一种负反馈调节机制所致。SCRC中β-Catenin的胞浆胞核异常表达与β-Catenin mRNA转录水平无明显关联。 4.β-Catenin mRNA含量降低与淋巴结转移、溃疡及浸润性生长相关,可作为结直肠癌生物学行为的判断指标之一。 5.单细胞拉曼光谱诊断识别模型能敏感地区分SCRC细胞和正常粘膜上皮细胞,具有潜在的临床细胞学诊断价值。单细胞拉曼光谱可提供丰富的有关结直肠癌细胞生化改变的信息。 6.激光光镊拉曼光谱分析方法是一种微创、几乎不用试剂而客观的检测方法,在肿瘤单细胞的临床诊断和研究中值得推广。


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