甘草酸对大鼠肝星状细胞TGF-β/smad信号传导通路的影响

【摘要】： 背景：肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理基础。肝纤维化发展的各个时期，肝星状细胞的活化和细胞外基质合成与降解的失衡是重要病理机制。其中转化生长因子β_1(TGF-β_1)起了关键作用。TGF-β信号通过跨膜丝氨酸／苏氨酸受体激酶传递入核，胞浆内进化保守的smad蛋白家族起了重要的转导作用。它们主要分为3类：受体调控型smads(R-smads)可直接与活化的Ⅰ型受体结合而磷酸化；共同介导型smads(Co-smads)是必需的中转分子，当R-smads磷酸化并与之形成寡聚体后可转位入核调控靶基因转录；抑制型smads(Ⅰ-smads)是TGF-β信号通路的负反馈调节。其中Smad2、3、4、7参与了信号转导。 甘草酸是目前广泛应用于临床的有效的慢性肝病治疗药物。它可能通过诱导干扰素α，抑制白介素6和肿瘤坏死因子表达，诱生前列腺素E，抑制磷脂酶A2的活性而起作用的。既往研究提示甘草酸可能通过干预TGF-B／smad信号通路来发挥抗纤维化作用的，但具体机制尚待进一步明确。 目的：研究甘草酸对TGF-β_1刺激的大鼠肝星状细胞中TGF-β／smad信号通路的影响。以期揭示甘草酸抗纤维化的分子机制。 方法：用SD大鼠分离肝星状细胞并体外培养。实验分成对照组和不同浓度甘草酸给药组(1μmol／l-1000μmol／l)。用MTT法研究对细胞增殖的抑制，台盼蓝拒染法和上清液LDH测定来研究对细胞活力的影响。ELISA法测定上清中HSC分泌的TGF-β_1。Western blot法检测α-SMA蛋白质表达水平。采用GEArray基因芯片检测对照组，TGF-β_1组，TGF-β_1+甘草酸100μmol／L组的基因表达，筛选与TGF-β／smad通路相关的有变化意义的靶基因。然后分成6组，分别为对照组、TGF-β_1组、TGF-β_1+不同浓度甘草酸组(1μmol／l-1000μmol／l)。采用半定量RT-PCR法检测smad2、smad3、smad7、α2Ⅰ型前胶原、α1Ⅲ型前胶原、纤溶酶原激活物抑制因子-1、TGFβ2型受体mRNA水平，采用Western blot法检测smad2、磷酸化-smad2、smad3、胞核-smad3、smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤溶酶原激活物抑制因子-1和TGFβ2型受体蛋白质表达水平。 结果：MTT实验显示100μmol／L-1000μmol／L甘草酸能明显抑制肝星状细胞增殖但不同浓度甘草酸并不影响肝星状细胞的活力。不同浓度甘草酸能逐渐抑制α-SMA蛋白质表达水平。1000μmol／L甘草酸能抑制上清液中肝星状细胞分泌的TGF-β1。基因芯片结果表明：经TGFβ_1作用后表达上调，再经甘草酸作用后表达下调的基因有16项；经TGFβ_1作用后表达下调，再经甘草酸作用后表达上调的基因有5项；经TGFβ_1作用后表达上调，再经甘草酸作用后表达上调更加明显的基因有2项。其中有7项基因与TGF-β／smad通路相关。RTR-PCR和Western blot结果验证了与基因芯片的一致性。表明TGF-β_1能增加smad2、smad3、smad7、α2Ⅰ型前胶原、α1Ⅲ型前胶原、纤溶酶原激活物抑制因子-1、TGFβ2型受体mRNA表达水平，同样增加smad2，磷酸化-smad2、smad3、胞核-smad3、smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤溶酶原激活物抑制因子-1、TGFβ2型受体蛋白质表达。1μmol／l-1000μmol／l甘草酸能逐渐降低smad2、smad3、smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤溶酶原激活物抑制因子-1的mRNA和蛋白质表达水平，但增加TGFβ2型受体的mRNA水平和蛋白质表达。 结论：高浓度甘草酸能抑制肝星状细胞增殖和TGF-β_1分泌：不同浓度的甘草酸能减少smad2、smad3、smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤溶酶原激活物抑制因子-1的mRNA和蛋白质表达水平，但上调TGFβ2型受体mRNA和蛋白质表达水平