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牙鲆变态过程中右眼移动的新模型及相关基因的筛选

鲍宝龙  
【摘要】: 在生物发育中的形态生成过程中,目前为止人们对左右轴建立和破坏的机制的理解仍然非常模糊。左右不对称的生物可以成为研究左右对称轴建立和破坏的一个很好的实验材料。鲽形目鱼类(俗称比目鱼类)的变态,使一只眼睛逐渐地移动至头部的另一侧,在外形上表现出明显地左右不对称。所以,研究鲽形目鱼类眼睛移动的机制,对揭示左右对称轴的是如何破坏的一个极好的研究切入口。 已有解释鲽形目鱼类眼睛移动现象的各种假说。Brewst认为眼睛移动是额骨变形造成的脑颅前部变形,促使眼睛移动,然后,通过眼睛移动的一侧的侧筛骨的快速扩大,进一步推动眼睛向上移动。此假说得到了Wagman、Okada等的支持。此假说是建立在对骨骼发育进行观察的基础上,可能由于技术上的原因,而忽视了眼睛周围其他组织的作用。 牙鲆(Paralichthys olivaceus)是目前研究眼睛移动现象最为集中的鲽形目鱼类,在变态后,其右侧的眼睛逐渐移至头部左侧。这里我们利用整体TUNEL方法和整体BrdU的原位检测技术,对从孵化后13天到43天的仔鱼的凋亡细胞和分裂细胞的整体分布进行了调查,在眼睛移动之前的仔鱼(17天),发现仅仅在脊髓和脊髓鞘中检测到细胞凋亡,而在其它部位没有检测到任何的细胞凋亡。在眼睛移动之后,在脑颅的一些骨骼、脑、眼睛、内耳、冠状幼鳍基部、尾鳍基部、下颌骨、鳃弓及肝脏中检测到细胞凋亡,初步表明细胞凋亡虽然与眼睛最初的移动没有直接的关系,但在牙鲆变态的其它事件中起作用。在眼睛移动之前的13天和17天仔鱼的眼睛周围,则检测到细胞分裂,并且发现右侧眼睛下方组织中的细胞分裂信号,要强于左侧相同的位置上的信号。在眼睛移动之后,发现在两只眼睛之间绕过头背部的区域出现了不均衡的分裂带,分裂带右侧的信号要强于左侧。随眼睛进一步向上移动,分裂带两端仍然维持在原来的位置,因此,右侧眼睛由于向上移动,使其下方的分裂细胞的数量比左侧眼睛下方的分裂细胞的数量要明显多得多,促使眼睛进一步向上移动。利用硫脲抑制右眼移动,发现,牙鲆的细胞分裂被完全抑制,而细胞凋亡则没有影响,这更直接证明细胞分裂是驱使牙鲆右眼开始移动的原动力。根据以上的结果,我们提出了一个新的解释鲽形目鱼类眼睛移动的模型。此模型认为,鲽形目鱼类眼睛移动的驱动力产生于在脑颅骨化之前;哪只眼睛移动,取决于左右眼睛下方组织的细胞分裂的数量,在眼睛移动之后,不均匀的细胞分裂带促进眼睛进一步移动。此模型能很好地解释鲽形目鱼类眼睛位置多样性的现象,与已被摒弃的Giard提出的假说也很类似。 关于眼睛移动的信号调控,已经有不少的研究。Inui Miwa首先发现甲状腺激素能促进眼睛移动,但不能确定哪种甲状腺激素受体参与其中。Hashimoto等已证明牙鲆右眼的移动的信号调控途径不同于脊椎动物内脏左右不对称的信号途径。因此,到目前为止,还没有一个明确的分子与眼睛移动有关。我们利用抑制差减杂交技术,以眼睛移动之前的17天仔鱼的头部RNA为驱动RNA,建立了眼睛开始移动的23天仔鱼头部的抑制差减cDNA文库,利用相对定量RT PCR技术初步筛选阳性克隆,利用整体原位杂交技术确定基因的时空表达模式,对于与右眼移动相关的候选基因,利用锚定PCR技术从建立的全长cDNA文库中克隆全长cDNA。从抑制差减cDNA文库克隆到的Sfrs3基因,发现在眼睛移动之后的头部表达水平明显增加,相比胚胎阶段,在变态G阶段和H阶段的Sfrs3基因表达水平分别增加了4倍和7倍。在右眼移动之前,Sfrs3基因的表达主要集中在身体的尾部,而很少在头部表达,随右眼进一步移动,表达逐渐向头部集中,在右眼移至接近头背部时(G阶段),Sfrs3基因的表达大部分集中在头部,而在身体后部基本没有表达。对头部的横截面的进一步观察,发现在右眼移动的G阶段,Sfrs3基因在右侧侧筛骨和右侧的“thickness skin”中表达,尤其是在“thickness skin”的表达信号要明显强于其周围的组织,“thickness skin”的位置位于我们新模型中G阶段细胞分裂带右眼的下方,同时,根据Okada的研究,“thickness skin”是一个细胞快速分裂的组织,逐渐变为Pseudomesial bar骨骼,推动右眼进一步向上移动。牙鲆Sfrs3基因是一个含RNA识别模序(RRM)和一个丝氨酸/精氨酸丰富的区域,和人类Sfrs3基因具有很高的同源性,是一个典型的RNA剪辑辅助因子。另外,人Sfrs3基因已证明参与细胞分裂周期的调节,牙鲆SFRS3很可能在“thickness skin”的细胞分裂中起作用。今后需要进一步的研究,明确确定牙鲆SFRS3参与牙鲆右眼移动。 另外,我们也探讨了GAPDH、βactin和18s rRNA三种作为RT PCR常用内标,在牙鲆发育阶段的稳定性。发现稳定性依此为18s rRNA>βactin>GAPDH。同时,我们也分析了抑制差减文库和全长cDNA文库的质量,分析了parvalbumin基因全长cDNA,为今后的相关研究打下了基础。


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