蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究

【摘要】：蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)原产于亚洲热带地区，具有很高的观赏价值和经济价值。类黄酮类色素是植物主要的花色素，而且在其它许多生物功能中发挥作用，如防紫外照射，植物——微生物间的相互作用以及雄性育性。查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS，EC2.3.1.74)是类黄酮合成途径的关键酶，催化一分子的香豆酰CoA与三分子的丙二酰CoA缩合生成4，5，7三羟基黄烷酮(narigenin chalcone)，是类黄酮合成的限速酶。 本研究利用一系列PCR方法克隆到3个新的蝴蝶兰查尔酮合酶基因。将它们分别命名为phchs3，phchs4和phchs5。首先，利用RT-PCR方法克隆到phchs3和phchs5的cDNA片段；利用常规PCR方法分离到phchs4的DNA片段。然后根据每个基因已知区域的序列设计反式PCR引物，进行反式PCR，得到全长基因。 Phchs3(GeneBank accession no．AY954515)包含有一个长为1173bp的开放读框，在保守的第60位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第一个和第二个核苷酸之间存在一个长为103bp的内含子。其编码的蛋白与其它物种的CHS有61-65％的同源性，并且包含了大部分CHS保守的活性位点。我们还得到了该基因684bp 5’非翻译区序列。在Phchs3的启动子区存在许多CHS基因特有的顺式作用元件，如G-box，W-box，P-box和TACPyAT motif等。 Phchs4(GeneBank accession no．AY825502)包含有一个长为1173bp的开放读框，在保守的第60位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第一个和第二个核苷酸之间存在一个长为109 bp的内含子。该基因编码由390个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白包含大部分CHS保守的活性氨基酸，与其它物种的CHS有61-65％的同源性。我们还得到了其618 bp 5’非翻译区序列。在phchs4启动子区发现了多种参与CHS基因表达调控的顺式作用元件。 Phehs5(GeneBank accession no．DQ089652)包含有一个长为1185 bp的开放读框，在保守的第61位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第一个和第二个核苷酸之间存在一个长为159 bp的内含子。不管在核苷酸水平还是氨基酸水平，Phchs5与其它兰科植物和其它科属植物CHS的同源程度高于与已知的蝴蝶兰CHS序列之间的同源程度。 Southern杂交表明，蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族至少由4个成员组成。 同源进化分析表明，兰科CHS基因在蝴蝶兰、石斛兰和Bromoheadia三个 属形成以前就已经分歧为两个亚家族。Phchs5属于缓慢进化的一支；phchs3和phchs4属于加速进化的一支。蛋白序列同源比较表明，许多CHS活性必须的氨基酸残基在加速进化的一支中不存在。 以半定量RT-PCR方法对三个蝴蝶兰CHS基因在处于不同发育阶段的不同花器官中的表达进行了鉴定。Phchs5是花器官中表达最强的基因，它特异的在花色素积累时期的花瓣和唇瓣中表达(阶段1至4)。Phchs5在花瓣中最高水平的表达发生在阶段3和4。这一时期，花色素在该组织中的积累速度最快。Phchs3和phchs4在花器官中的表达水平较phchs5低。Phchs3在发育早中期的着色的花被中表达，也在发育晚期无色的生殖器官中表达。与Phchs5相似，phchs4仅在花瓣和唇瓣中表达。它在早期的花瓣(阶段1-3)和晚期的唇瓣中微量表达(阶段4)。上述结果为蝴蝶兰单个CHS基因的差异表达提供了新的事实依据。 对phchs5在不同蝴蝶兰花色品种中的表达进行鉴定分析，结果进一步证明该基因特异的在花瓣和唇瓣中表达，其表达水平明显与组织中花色素积累水平一致。它在“紫红”品系(紫红花瓣)花瓣中的表达水平大大高于“黄花红唇”(黄色花瓣)和“白花黄唇”(白色花瓣)花瓣中的水平。 以phchs3的外显子2序列作为目的基因转化烟草可以使转基因植物的花瓣颜色加深。这些数据证实了phchs3在花色素合成中的功能，为过量表达蝴蝶兰CHS基因来进行其它植物的花色改良奠定了理论基础。