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细胞色素b_5向细胞色素c的结构转化以及不同表达体系对其结构、性质和功能的影响

林英武  
【摘要】: 血红素蛋白是一大类含有原卟啉Ⅸ(血红素,heme)作为辅基的金属蛋白,在生命体系中执行着重要的生物功能,如氧载体功能(血红蛋白,Hb和肌红蛋白,Mb),电子传递功能(细胞色素b_5,cyt b_5和细胞色素c,cyt c等),生物催化功能(细胞色素P450,cyt P450和细胞色素c过氧化物酶,CcP等),以及生物传感功能(CO传感器CooA和NO传感器sGC等)。相同的辅基heme如何被不同的蛋白分子所利用,来执行不同的生物功能,一直是化学生物学和蛋白质化学研究领域所关注的重点,人们正试图对这一问题进行解答来认识金属蛋白结构—性质—反应—功能之间所蕴含的精妙关系。 Cyt b_5是血红素蛋白中电子传递蛋白的典型代表,其辅基heme与蛋白肽链的结合是以非共价键的方式进行的,结合能力主要来自heme轴向双组氨酸His39和His63的配位作用,以及氢键和疏水作用等。Cyt b_5与cyt c不同,后者辅基heme的两个乙烯基与蛋白肽链上结合heme的结构片段域Cys-Xaa-Xaa-Cys-His(CXXCH)中的半胱氨酸形成了两个硫醚键,因而以共价键的方式相互结合。同时,与cyt c或Mb相比,cyt b_5分子中辅基heme有着更大的溶液暴露程度。这些原因直接导致了cyt b_5具有较低的辅基结合稳定性。 纵观cyt b_5的研究历程,我们发现关于cyt b_5轴向配体的研究相对较少,这主要是因为heme轴向配体的突变会很大程度上降低cyt b_5的辅基结合能力,以至于通过体内表达的方法得不到轴向突变体的全蛋白(holo-protein),只能表达出没有结合heme的脱辅基蛋白(apo-protein)。后者由于蛋白稳定性低,而且没有holo-protein的特征红色,给后续分离纯化带来了很大的困难,操作过程较提纯cyt b_5复杂得多,往往需要投入很多时间和精力,才能获得足够纯度的蛋白用于进一步实验研究。 然而,关于血红素蛋白结构、性质和功能的很多研究,正是集中在活性中心辅基heme的轴向配体上。因此,如何提高cyt b_5辅基结合的稳定性,以及如何简化cyt b_5的分离纯化方法,特别是如何使用简便的提纯方法来获得cyt b_5轴向突变体的apo-protein,是一系列值得研究与探索的课题。 由于cyt b_5中并不存在cyt c中所具有的结合heme的结构片段域CXXCH,而且整个蛋白肽链中并不存在Cys,因此无法形成类似cyt c中的硫醚键。通过对cyt b_5晶体结构信息作仔细深入地研究后,我们发现距离heme 2-乙烯基和4-乙烯基最近的氨基酸残基分别为Ser71和Asn57,它们的β位碳原子与2-、4-乙烯基α碳原子的距离分别为4.32和3.86(?)。这样的距离很适合共价键的形成,如果将这两个位点的氨基酸残基分别用Cys取代,在蛋白表达的过程中,所引入的Cys极有可能分别与heme的两个乙烯基发生加成反应,形成类似cyt c中的硫醚键。因此,我们运用定点突变的方法构建了cyt b_5,N57C、cyt b_5 S71C以及cyt b_5 N57C/S71C突变体,并对其进行了性质表征。 研究证明,在cyt b_5分子中heme乙烯基附近适当的位置引入半胱氨酸,通过体内表达的方法,的确可以实现辅基heme与蛋白肽链的共价键合。所引入的Cys与heme分别形成了两种不同的Cysteine-Heme共价键:其中在57位形成了经典的硫醚键,而在71位形成了非典型的[heme-CO-CH_2-S-CH_2-C_α]键。这种差别主要取决于所引入半胱氨酸与heme乙烯基之间的距离,乙烯基自身的取向,以及各自所处的微环境等因素。研究结果也表明并不需要构建类似cyt c中所特有的结合heme的结构片段域CXXCH,即可实现cyt b_5向cyt c的结构转化,这说明CXXCH对于heme与蛋白肽链间的共价键合并非是必需的因素。而且,我们研究发现,具有heme共价键合的cyt b_5(cyt c-like cyt b_5)在去折叠状态下表现出相当高的过氧化酶催化活性。这些研究成果为我们认识c-型细胞色素的形成机理,以及认识血红素蛋白的结构—性质—反应—功能之间的关系,提供了重要的信息。 在寻求分离纯化cyt b_5的简化方法过程中,我们尝试了用谷胱甘肽S-转移酶表达系统,将cyt b_5表达为GST-cyt b_5融合蛋白的方式进行分离纯化。实验结果证实,cyt b_5的确可以以融合蛋白的形式进行表达,而且可以在体内表达得到结合有辅基heme的holo-protein。GST-cyt b_5融合蛋白的表达体系具有其他cyt b_5表达体系无法比拟的优越性,其操作相对简单,只需经过一步GST亲和层析即可得到目标融合蛋白。同时,融合蛋白的性质表征表明:融合蛋白内GST与cyt b_5之间的蛋白—蛋白相互作用相对较弱,它们的相互融合并没有很大程度上改变彼此的整体结构与基本功能。一方面GST-cyt b_5融合蛋白有着与cyt b_5相类似的性质与功能,另一方面它又具有GST的亲和性,这使得融合蛋白具有双重功能与应用前景。然而,在表达GST-cyt b_5轴向突变体蛋白时,只能得到apo-protein,而且,GST对heme的高亲和性严重影响了GST-cyt b_5突变体蛋白apo-protein与heme的体外重组。因而,GST表达体系并不适合用来获得涉及cyt b_5轴向突变的突变体蛋白holo-protein。 此外,我们还通过组氨酸标记表达体系,在cyt b_5分子的N-端引入(His)_(6-tag),然后用Ni~(2+)亲和柱对cyt b_5进行分离纯化。研究表明,(His)_(6-cyt b_5)有着与cyt b_5相类似的光谱学、电化学以及化学稳定性,说明(His)_(6-tag)的引入对蛋白的结构、性质和功能没有明显地影响。同时,(His)_(6-tag)的引入不影响apo-protein与heme的体外重组。因此,这种方法更适用于cyt b_5轴向突变的突变体蛋白holo-protein的获得。通过这种方法,我们获得了(His)_(6-cyt 6j H39G单点突变体, 以及轴向His39与Gly42进行序列上互换的双点突变体蛋白[(His)_(6-cyt) b_5 H39G/G42H]。对突变体蛋白表征的结果表明:当heme轴向配位的组氨酸由39位转移至42位,仍能形成heme的轴向配体,只是相对天然的His39来说,His42的配位能力较弱。这一研究表明cyt b_5分子的蛋白肽链具有一定的柔韧性,因此要在cyt b_5的heme疏水腔中构建类似天然过氧化物酶分子中所存在的远端组氨酸(distal histidine),困难远比在蛋白结构相对更加刚性的Mb分子中构建要大得多。这些研究成果进一步拓宽了我们对cyt b_5的结构—性质—反应—功能关系的认识。


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