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外源性全反视黄酸对豚鼠屈光状态和眼发育影响的研究

李瑾  
【摘要】: 第一部分外源性全反视黄酸对豚鼠屈光状态和眼后部组织发育的影响研究 目的观察豚鼠球周注射全反视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对屈光状态和眼后部组织发育的影响。方法选取四周龄英国短毛豚鼠48只,分为ATRA组(n=24)和正常对照组(n=24)。ATRA组随机选取一眼(n=24)于暗光下球周注射0.4mg/mL浓度全反视黄酸0.1mL。对照组随机选择一眼(n=24)同法球周注射稀释ATRA用的相应浓度二硝基亚枫(DMSO,0.001ml/L)和注射用水0.1mL。注射前及注射后四周分别测两组的屈光度、玻璃体腔深度和眼轴长度,并取注射后四周及八周每组各6只眼球做病理检查。统计学检验为组间T检验。结果注射前ATRA眼平均屈光度为3.73D±0.75D,玻璃体腔深度3.09mm±0.67mm,眼轴长6.44mm±0.27mm;对照眼平均屈光度为3.72D±0.83D,玻璃体腔深度3.19mm±0.74mm,眼轴长为6.54mm±0.38mm,ATRA眼和对照眼间差异无统计学意义(P分别为0.96;0.68及0.26)。注射四周后对照眼屈光度为3.56D±0.80D,玻璃体腔深度为3.57mm±0.54mm,眼轴长为7.80mm±0.26mm,ATRA眼屈光度为0.90D±1.25D,玻璃体腔深度为3.98mm±0.68mm,眼轴长为8.50mm±0.39mm。ATRA眼和对照眼各参数间比较差异均具有显著统计学意义(三者均P<0.001)。注射四周后ATRA眼眼轴增长量与对照眼的相比差异具有显著的统计学意义。(分别为2.04±0.06mm和1.24±0.04mm,t检验:P<0.001);注射四周后ATRA眼玻璃体腔深度增加较对照眼差异也具有显著的统计学意义(0.89±0.05mm和0.36±0.04mm,t检验:P<0.001)。病理切片以Leica光学显微镜图像分析系统测量示注射四周后ATRA处理眼的巩膜厚度为124.39±6.48μm,脉络膜为42.21±2.32μm;正常对照眼的巩膜厚度为83.59±5.28μm,脉络膜为92.83±8.26μm;八周后ATRA眼的巩膜厚度为81.62±12.96μm,脉络膜为44.53±4.16μm;对照眼的巩膜厚度为118.53±6.30μm,脉络膜为162.98±21.87μm。统计学检验提示注射后四周及八周的ATRA眼较对照眼后极部相似部位的脉络膜变薄(P值分别为8.34×10~(-16)和7.32×10~(-15),均<0.001),注射后四周巩膜层厚度增加(P=4.38×10~(-14),<0.001),注射后八周变薄(P=2.77×10~(-8),<0.001)。结论局部外源性应用一定浓度的全反视黄酸可诱导豚鼠相对性近视漂移。并可观察到脉络膜变薄和玻璃体腔的深度增加等现象。 第二部分形觉剥夺和外源性全反视黄酸对豚鼠锥细胞视蛋白表达的影响对比研究 目的观察一定浓度的外源性ATRA对豚鼠锥细胞视蛋白表达的影响,并与形觉剥夺性近视豚鼠的锥细胞视蛋白表达进行比较。方法出生一周豚鼠42只,分为ATRA组(n=14),正常对照组(n=14),形觉剥夺(Form deprived myopia,FDM)组(n=14),按自然亮暗周期饲养。视黄酸组随机选取一眼于暗光下球周注射0.4mg/mL浓度ATRA0.1mL,FDM组随机选取一眼以半透明橡胶遮盖,对照组随机选择一眼球周注射稀释ATRA用的相应浓度二硝基亚枫(0.001ml/L)和注射用水共0.1mL。四周后取眼球行RT-PCR技术检测神经视网膜M-视蛋白和S-视蛋白的mRNA表达,并进行豚鼠视网膜铺片后免疫组织化学方法观察两种视蛋白的分布和表达密度,一抗为兔抗鼠红/绿锥视蛋白抗体或蓝锥视蛋白抗体,二抗为羊抗兔IgG带488荧光抗体。以Leica光学显微镜和Leica共聚焦显微镜观察豚鼠视网膜腹侧(下方)和背侧(上方)及中央区的锥细胞视蛋白的表达。结果正常豚鼠的视网膜短波敏感锥细胞(Short wave-lengthsensitive opsin,S-opsin)分布为腹侧(下方)多于背侧(上方);中央密度最高,密度变化为突变。豚鼠的中波敏感锥细胞(Medium wave-length sensitive opsin,M-cone)分布在背部(上方)多于腹侧(下方),中央密度最高,密度变化为渐变;正常组S-opsin的表达密度:下方为805.0mm~(-2)±203.3mm~(-2),上方为100.0mm~(-2)±57.7mm~(-2);中央为1637.2mm~(-2)±314.1mm~(-2)。ATRA组:下方为499.4mm~(-2)±147.6mm~(-2),上方为87.8mm~(-2)±44.9mm~(-2),中央为968.4mm~(-2)±210.2mm~(-2);FDM组:下方为640.9mm~(-2)±196.8mm~(-2);中央为:1016.7mm~(-2)±144.6mm~(-2),上方为70.9mm~(-2)±30.8mm~(-2);正常组M-opsin的表达密度:上方为946.2mm~(-2)±388.5mm~(-2),中心为1666.7mm~(-2)±137.8mm~(-2),下方为175.0mm~(-2)±100.9mm~(-2);ATRA组:上方为1326.1mm~(-2)±267.0mm~(-2),中心为2984.0mm~(-2)±613.4mm~(-2),下方为232.9mm~(-2)±173.6mm~(-2);FDM组:上方为1436.7mm~(-2)±366.0mm~(-2),中心为:2780.0mm~(-2)±180.5mm~(-2),下方为318.2mm~(-2)±172.7mm~(-2)。FDM和0.4mg/ml浓度的ATRA0.1ml局部球周注射用后均使豚鼠视网膜的M-opsin的表达密度均较正常对照增加(二者均P<0.05),S-opsin的表达密度减少(二者均P<0.05);RT-PCR检测示M-视蛋白的相对光密度值为1.25±0.11(ATRA眼),1.06±0.07(FDM眼),0.51±0.10(对照眼),S视蛋白的相对光密度值为0.61±0.09(ATRA眼),0.70±0.07(FDM眼),1.25±0.06(对照眼)。FDM眼与对照眼,ATRA处理眼与对照眼相比,M视蛋白的mRNA表达均增加,S视蛋白的mRNA表达均下降,两因素方差分析示两组实验处理眼与对照眼的差别均有统计学意义(P<0.05)。结论锥细胞视蛋白的表达改变可能在豚鼠形觉剥夺性近视中起了作用。ATRA对感光细胞发育具有靶向性作用。一定浓度的ATRA球周局部作用后豚鼠锥细胞视蛋白的mRNA表达及分布和表达密度的改变与形觉剥夺性近视眼较为相似,支持ATRA在豚鼠屈光状态发育的信使作用。 第三部分全反视黄酸对培养的人视网膜色素上皮细胞的作用研究 目的观察ATRA对培养的视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium,RPE)的形态、增殖的影响以及对RPE细胞表达和分泌转化生长因子-β_2(Transforming growthfactor-β_2,TGF-β_2)的影响。方法RPE传代至第三代后以1*10~5/孔的密度接种于96孔板或以1*10~6的密度接种于250ml培养瓶,以10%FBS的F12培养液培养48小时后转为0.5%FBS的F12培养液,12小时后培养液转换为F12和1nM/mL,5nM/mL,10nM/mL,20nM/mL,30nM/mL的ATRA。以未加ATRA但加入溶解ATRA的相应浓度DMSO作正常对照。48小时后观察RPE细胞形态,并以MTT法测定其增殖情况,以流式细胞技术检测其细胞凋亡。以免疫组化方法检测RPE细胞TGF-β_2表达并以酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)方法测定其上清液的TGF-β_2浓度。结果不同ATRA的浓度对RPE细胞的形态,增殖有不同的影响。1nM/mL,5nM/mL的ATRA对RPE细胞的增殖无影响,细胞形态正常,MTT法显示这些浓度下ATRA对RPE的增殖影响无统计学意义(p>0.05);10nM/mL,20nM/mL,30nM/mL的ATRA抑制RPE的增殖,MTT法显示ATRA对RPE有明显的抑制作用(三种浓度下p值分别为p<0.05,p<0.01,p<0.001)。该效应呈浓度依赖性反应。RPE细胞增大变平,突起减少;流式细胞技术检测提示10nM/mL,20nM/mL,30nM/mL浓度下细胞凋亡率分别为14.58%,19.95%和21.69%。免疫组化方法检测提示,加入RPE细胞的ATRA浓度大于10nM/mL时,TGF-β_2的表达随着其浓度增高而增加,ELISA结果提示,ATRA浓度大于10nM/mL时,RPE分泌TGF-β_2的浓度增加。结论一定浓度的ATRA可维持培养的人RPE的生长,10nM/ml及以上的浓度引起RPE的增殖抑制,并可诱导RPE的凋亡。10nM/mL及以上浓度的ATRA诱导RPE的TGF-β_2表达和分泌增加。


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