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GDNF治疗缺血缺氧性脑损伤的作用途径及其信号转导机理的研究

呙登俊  
【摘要】:题目:GDNF治疗缺血缺氧性脑损伤的作用途径及其信号转导机理的研究 研究背景:神经营养因子在神经细胞的发育、分化、存活、突触的形成中起重要作用,对它的研究已成为神经科学领域中的热点之一。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)于1993年由Lin等人从大鼠胶质细胞系B49的培养液中纯化得到,最初的研究表明GDNF对多巴胺能神经元及运动神经元有很强的营养作用,继后的实验发现它对交感神经元、去甲肾上腺素能神经元、感觉神经元亦有一定营养作用,因而GDNF具有广谱性神经营养作用。并且在动物实验中显示GDNF对多种原因造成的神经损伤具有明显的保护作用,从而为神经系统疾病的治疗开辟了新的途径。 由于血脑屏障的存在,给GDNF的应用带来一定限制,这也是其它神经营养因子在应用方面所面临的难题。目前,GDNF的应用主要采用以下三种方法:一种是直接将纯化的GDNF注入局部脑组织或脑室内。由于在一定时期内要维持较稳定的浓度需要多次注入,这必然会带来不利影响。另一种方法是利用基因工程的方法,将GDNF基因直接转染到脑内神经细胞,使其能够合成并分泌GDNF而发挥作用。此外,也可在体外选用适宜的细胞,将GDNF基因转导入细胞,再将细胞移植入脑内。 GDNF的神经营养作用主要是通过两类受体亚基介导,即胶质细胞源性神经营养因子受体α亚基和原癌基因RET亚基。GDNF首先与α亚基GFRα1结合形成GDNF—GFRα1复合物,该复合物再与RET结合,引起RET二聚化和酪氨酸残基自磷酸化。RET亚基激活后,主要通过两条信号转导通路向细胞内传递信息,从而引起下游的分子效应:PI-3Kinase和MAPKs信号通路。对于GDNF的PI-3Kinase和MAPKs两条信号通路在缺血性脑(神经)损伤中的相对作用,尚未见系统的研究报道。 目的:研究胶质源性神经营养因子GDNF基因转导的细胞侧脑室内移植治疗局灶性缺血性脑损伤大鼠的可行性及最佳治疗时机,并探讨侧脑室注射GDNF对局灶性缺血性脑损伤大鼠的神经保护作用,及其信号转导机制。 方法:第一部分,采用基因工程技术,将GDNF-GFP基因转导入SH-SY5Y细胞,建立GDNF-GFP工程细胞,并经侧脑室注射入大脑中动脉阻断的局灶性缺血脑损伤大鼠的脑中,进行肢体功能评分、TTC染色及TUNEL法检测凋亡细胞;第 二部分,采用TTC染色法、MTT法、免疫组织(细胞)化学法、RT-PCR及Western-blot法检测在有或无U0126/LY294002存在的情况下,GDNF对局灶性缺血脑损伤大鼠或体氧损伤的体外大鼠皮层细胞的神经保护,及其对凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax和水通道蛋白AQP4的表达的影响。 结果:第一部分,给予GDNF可以改善缺血性脑损伤后动物的肢体功能,降低脑梗塞体积和细胞凋亡水平。缺血前1d工程细胞移植组动物的肢体功能评分优于同一时间GDNF注射组。缺血前1d及缺血后6h,工程细胞移植组脑梗塞体积和细胞凋亡水平亦低于同一时间GDNF注射组。第二部分,在U0126存在的情况下,GDNF可更有效地改善动物肢体功能和细胞状态,减小脑梗塞体积,改善细胞活力,并可调节水通道蛋白AQP4的基因表达,减轻脑(细胞)水肿,而凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax水平与单纯给予GDNF组无明显差异。在LY294002存在的情况下,GDNF的脑保护到抑制,动物肢体功能、细胞状态、脑梗塞体积和细胞活力均不如单纯给予GDNF组,AQP4的基因表达水平与单纯给予GDNF组无明显差异,但其凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax水平低于单纯给予GDNF组。 结论:1.GDNF对缺血性脑损伤大鼠有确切的神经保护作用,可抑制缺血性脑损伤后的细胞凋亡,减小脑梗塞体积,用GDNF基因转导的工程细胞移植治疗是一种可行的途径,效果优于经侧脑室直接给药。2.缺血损伤前1d预防性给药和缺血后立即(6小时内)给药是GDNF治疗脑缺血的最佳时机。在缺血后1d内进行GDNF工程细胞移植或侧脑室直接注射GDNF仍有一定的疗效。3.在缺血性脑损伤后GDNF主要通过PI-3K和MAPKs信号转导通路发挥作用:通过激活PI-3K信号转导通路可以抑制细胞凋亡,促进细胞存活。通过激活MAPKs信号转导通路可调节水通道蛋白AQP4的基因表达,从而调节脑水肿的发生。


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