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甲基乙二醛、晚期糖基化产物对人腹膜间皮细胞生物学作用的体外研究

洪富源  
【摘要】: 目的:1.研究葡萄糖降解产物甲基乙二醛(MGO)、晚期糖基化产物(AGE-HSA)对人腹膜间皮细胞(HPMC)分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的影响,参与的信号传导通路及Simvastatin的干预作用。探讨MGO和AGE-HSA对腹膜血管生成的影响及Simvastatin的干预作用。2.研究MGO和AGE-HSA对HPMC细胞毒性、细胞增殖的影响及参与信号传导通路。探讨MGO和AGE-HSA对腹膜间皮细胞的损伤的影响3.研究AGE-HSA对HPMC合成细胞外基质的作用及参与信号传导通路。探讨AGE-HSA对腹膜纤维化的影响。 方法:分别用不同浓度的MGO、AGE-HSA、细胞内信号传导通路抑制剂、抗氧化剂(NAC)及Simvastatin作用于HPMC。1.采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HPMC的VEGF、MCP-1、纤维连接蛋白(FN)的基因和蛋白的表达。2.采用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平。3.采用免疫印迹(Western blot)检测MAPK信号传导通路的激活。4.采用相差显微镜下观察HPMC细胞形态的改变。5.采用MTT法检测细胞活力。6.采用~3H-胸腺嘧啶核苷渗入法检测细胞增殖。 结果:1.MGO和AGE-HSA以时间和浓度依赖的方式刺激HPMC的VEGF mRNA和蛋白的表达,二者有协同作用。2.AGE-HSA以时间和浓度依赖的方式刺激HPMC的MCP-1 mRNA和蛋白的表达,MGO对HPMC的MCP-1 mRNA的表达则没有明显的影响。3.MGO在刺激HPMC表达VEGF的同时,诱导细胞内ROS的产生、同时以时间依赖方式促进P-38MAPK磷酸化。抗氧化剂NAC抑制细胞内ROS后,P-38MAPK磷酸化减少,同时VEGF表达也减少。P-38MAPK特异性阻断剂SB203580阻断P-38MAPK磷酸化后,VEGF表达也减少。4.AGE-HSA在刺激HPMC表达VEGF、MCP-1的同时,诱导细胞内ROS的产生、同时以时间依赖方式促进P-42/44MAPK、P-38MAPK磷酸化,用抗氧化剂NAC抑制细胞内ROS后,P-42/44MAPK、P-38MAPK磷酸化减少,同时VEGF和MCP-1表达也减少。MEK特异抑制剂PD98059抑制P-42/44MAPK磷酸化后、或者P-38MAPK特异性阻断剂SB203580抑制P-38MAPK磷酸化后,VEGF和MCP-1表达也减少了。AGE-HSA不激活JNK信号通路。5.Simvastatin能够以剂量依赖的方式抑制AGE-HSA诱导的MCP-1表达,FPP和GGPP能够逆转Simvastatin的作用,而Simvastatin对VEGF表达则没有明显的作用。6.高浓度的MGO(160~320μM)以浓度依赖的方式使细胞活力下降,形态发生改变和抑制细胞增殖,而低浓度的MGO(0~80μM)以及AGE-HSA对细胞活力、形态和细胞增殖没有明显的影响。7.AGE-HSA以时间和浓度依赖的方式刺激HPMC合成FN。8.PKC激动剂佛波酯PMA也能刺激HPMC合成FN,先用PMA耗竭细胞内PKC或加用PKC抑制剂Calphostin C后,可以抑制AGE-HSA诱导的FN分泌。 结论:1.MGO和AGE-HSA部分通过诱导细胞内ROS、激活P-42/44MAPK、P-38MAPK信号通路,促进VEGF、MCP-1表达,参与腹膜血管生成。二者有协同作用。2.高浓度的MGO具有明显细胞毒性和抑制细胞增殖作用,参与长期腹透腹膜间皮细胞的损伤。3.AGE-HSA部分通过活化PKC诱导细胞内ROS的表达增加,促进HPMC合成和分泌FN。参与腹膜纤维化。4.Simvastatin可以通过非降脂作用抑制AGE-HSA诱导的MCP-1表达,这提示他汀类药物在防治CAPD患者长期腹透引起的腹膜血管生成、腹膜纤维化、腹膜失超滤方面有潜在的治疗价值。


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