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mRFP1报告基因表达及Gal4-UAS二元表达系统在小鼠中的应用

朱化星  
【摘要】: 模式生物对揭示生命的奥秘、研究人类疾病的发生机制与治疗方法等具有重大意义。各种模式生物研究技术的相互借鉴极大促进了模式生物研究和生物医学的发展。我们对转基因小鼠标记基因、GAL4/UAS系统在转基因小鼠中组织特异性表达外源基因、哺乳动物中RNAi的非特异性抑制作用等进行了探索,为这些技术在小鼠中的移植与应用做了初步的研究。 我们研究了一系列荧光蛋白和毛色等标记基因在转基因小鼠中的应用。首次报导了mRFP1报告基因在转基因小鼠中的应用。我们发现mRFP1外显率高、日光灯下清晰可辨、剂量效应明显,可方便地区分纯合子与杂合子,适于用作转基因标记。我们还发现mRFP1在小鼠各组织中都可表达,有望为器官与细胞移植实验提供方便。 我们培育并筛选了一系列不同组织特异性高表达的GAL4转基因小鼠品系,包括全身、肌肉、表皮细胞特异性的GAL4。通过一系列体内检测UAS转基因的表达我们发现采用CMV基本启动子的UAS表达框具有最强的诱导效率,而采用hsp70基本启动子片段的UAS转基因则具有最低的非诱导背景表达。我们筛选了全长GAL4、或携带G5、G53、VP16等不同激活结构域的GAL4转基因,发现与VP16融合的GAL4(GV)具有最高的诱导效率。因此我们选用GV与5xUAS-CMV转基因小鼠培育并检测到较好的诱导表达。 小的双链RNA会导致哺乳动物非特异性基因表达抑制。我们共转染两个转录方向相反的质粒在细胞内形成双链RNA,发现其通过激活PKR表达而激活干扰素信号途径,引起非特异性的蛋白质合成下降。利用U6启动子驱动一段针对PKR的siRNA,我们成功的降低了PKR的表达水平,并发现它可以抑制双链RNA对干扰素信号途径的激活,从而为降低RNAi在哺乳动物中的非特异性提供了可能。


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