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先天性遗传性白内障的蛋白质组学研究

季樱红  
【摘要】: 先天性白内障是儿童常见的致盲眼病,发达国家发病率为1-4/10,000万儿童,而在发展中国家,发病率较高,为5-15/10,000万儿童。全世界有13-20万双侧先天性白内障患者致盲,并以2-4万/年递增。 遗传因素在先天性白内障的发病机制上起了主要作用。迄今为止,至少发现了先天性单纯性白内障相关的12个位点和15个基因。这些基因包括晶状体蛋白(α、β、γ晶状体蛋白)、膜蛋白、细胞骨架蛋白、转录因子和功能尚不明确的蛋白如Lim2等。然而由于生命活动真正的执行者是蛋白质,基因水平无法涵盖并解释一切表型,随着蛋白质组技术的发展,先天性白内障的分子生物学研究也将进入蛋白质组阶段。 由于动物模型具有良好的可对比性,而且实验条件易于操控。本研究以先天性遗传性白内障小鼠为对象,观察突变小鼠晶状体组织形态学的变化;突变小鼠产生白内障,在基因水平上证实是Crygs基因突变,而对基因突变引起的下游蛋白质的变化未见报道。此种Crygs基因突变究竟是否引起γS晶状体蛋白和/或其它蛋白质的变化?本研究采用先进的蛋白质组技术手段,将突变与正常小鼠晶状体总蛋白质进行对比,从中寻找差异蛋白,阐明遗传性白内障的蛋白质组变化,了解突变的Crygs基因对晶状体蛋白质的影响。此外本研究通过收集先天性白内障家系,发现先天性白内障少见的遗传方式——X性连锁显性遗传;并以此家系中白内障患者和健康对照者血清为研究对象,其目的希望能够直接从血清中获得诊断标志物,最终提高白内障的早期发现与早期诊断能力。 第一部分:先天性遗传性白内障小鼠的晶状体组织学及超微结构改变 目的: 了解先天性Crygs基因突变小鼠晶状体的组织学及超微结构改变。 方法: 采用先天性Crygs基因自发突变小鼠动物模型,遗传方式为隐性遗传。将5周龄的突变小鼠和正常小鼠分为两组,扩瞳后进行眼部和生物裂隙灯显微镜照相。脊椎脱臼处死小鼠后摘除眼球,整个眼球固定并制作组织病理石蜡切片,HE染色后进行光镜观察。取出小鼠晶状体,戊二醛固定后分别行扫描电镜和透射电镜标本制作及检查。 结果: 和正常小鼠相比,Crygs基因突变小鼠双眼产生对称的核性白内障,晶状体核区完全被白色混浊所覆盖,而周边皮质透明。组织病理学上,突变小鼠的晶状体可出现Morgagnian(马氏)小体;前囊下皮质纤维排列疏松,出现空泡样改变;赤道部上皮细胞增殖明显,并向前后极迁移;核心部嗜伊红深染,纤维短缩,排列紊乱;后囊膜下出现空泡变性。透射电镜显示突变小鼠晶状体细胞间隙增宽,胞浆中见较多肿胀线粒体,胞浆颗粒粗大。扫描电镜显示突变小鼠的晶状体皮质和核性纤维排列肿胀且紊乱,球窝连接异常,并可出现马氏小体和空泡样变性。 结论: Crygs基因突变可导致晶状体上皮细胞的增殖或变性,损害晶状体细胞间的连接及纤维间的排列。γS晶状体蛋白主要位于皮质区,而其突变产生核性白内障,提示核区可能是γS晶状体蛋白继发引起其它蛋白改变所致,需进一步进行晶状体的蛋白质分析。 第二部分:先天性遗传性白内障小鼠的晶状体蛋白质组分析 目的: 比较研究先天性遗传性白内障的晶状体总蛋白质表达谱的改变,探讨基因突变小鼠的蛋白质变化,并了解突变基因对晶状体蛋白质的影响。 方法: 采用先天性遗传性白内障动物模型,为自发的Crygs突变隐性遗传小鼠。将5周龄的白内障小鼠和正常小鼠分为两组,提取晶状体总蛋白,进行固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向电泳,胶体考马斯亮蓝R-250染色,使用PDQuest 7.30图像分析软件分析电泳图像。选择部分差异蛋白点胶上酶解,应用基质辅助激光解析电离飞行时间/飞行时间(MALDI-TOF/TOF)仪器进行串联质谱(MS/MS)鉴定及分析。 结果: 不同的上样量可以分离不同丰度晶状体蛋白质。高上样量(如882μg)和12%分离胶能够较好地分离低丰度蛋白,而高丰度蛋白点互相重叠。低上样量(如190μg)时和12.5%浓度分离胶可很好地分离高丰度蛋白——晶状体蛋白。对蛋白质图谱进行重复性分析,各3次,将其中的一块胶定为参考胶进行3块胶间的蛋白质点的匹配,上样量为882μg时,白内障组和正常组的平均匹配率分别为78.7%和81.3%;上样量为190μg时,白内障组和正常组的平均匹配率分别为90.4%和92.5%。上样量为882μg时,白内障和正常小鼠分别检测到417±53个蛋白点(n=3)和370±41蛋白点(n=3)。以正常图谱为参考胶,正常组和白内障组的平均匹配率分别为67%和53%。上样量为190μg时,白内障和正常小鼠分别检测到60±7个蛋白点和57±5个蛋白点(n=3),以正常图谱为参考胶,正常组和白内障组的平均匹配率分别为93%和89%。不同胶间蛋白质斑点的位置偏差在IEF方向(横向)平均为(0.92±0.15)mm,在SDS-PAGE方向(纵向)平均为(1.28±0.21)mm。选择16个蛋白点进行质谱鉴定,所有16种蛋白质都得到了确切的鉴定,包括BFSP/filensin、γS、γF、βA1、βB1、βB2和αB等7种差异蛋白。突变小鼠晶状体正常γS、念珠状纤维结构蛋白(BFSP/filensin)缺失,γF表达下调(<4倍),异常βA1、βB1、βB2和αB表达上调(>4倍),分子量比正常小,提示βA1、βB1、βB2和αB可能发生裂解。 结论: 与正常晶状体相比,先天性遗传性白内障有明显的差异性蛋白表达谱。基因的突变可导致下游蛋白质的变化,蛋白质的双向电泳和质谱分析有助于下游蛋白的功能分析。对于研究γS晶状体蛋白的功能,Crygs突变隐性遗传小鼠是很好的动物模型。Crygs基因突变导致γS晶状体蛋白的异常,并引起细胞骨架蛋白(BFSP/filensin)和其它晶状体蛋白(γF、βA1、βB1、βB2和αB等)继发改变,从而间接诱发白内障。推测γS晶状体蛋白可抑制内源性水解酶的产生,从而抑制晶状体蛋白的裂解。γS晶状体蛋白可能和αB晶状体蛋白一样,不仅仅为结构蛋白,还具重要的功能。 第三部分:先天性遗传性白内障一家系的血清蛋白质组研究 目的: 比较研究先天性白内障患者的血清总蛋白质的变化及其意义。 方法: 收集先天性遗传性白内障一家系,对家系成员进行裂隙灯显微镜检查,抽取静脉血,收集正常者和患者的血清,采用比较蛋白质组学技术,进行固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向电泳,硝酸银染色,ImageMaster图像分析软件对蛋白质图谱进行分析。 结果: 患者裂隙灯检查表现为双眼对称的绕核性白内障,为胎儿核的周围绕核混浊,而皮质和胚胎核透明。临床遗传特点符合X性连锁显性遗传。家系中年龄相近的正常者和白内障患者的血清总蛋白双向电泳图谱并未出现明显差异。 结论: 发现先天性白内障少见的遗传方式——X性连锁显性遗传。血清总蛋白质未出现显著差异蛋白,可能与晶状体本身无血管且与血液隔离相关,也可能与血清低丰度蛋白难以分离相关。突变的基因可能只在晶状体组织表达。晶状体的组织蛋白质组学可能对先天性白内障的发病机制研究更有意义。


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