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水稻中两个串联排列的GST基因功能的初步研究

胡廷章  
【摘要】: 以玉米In2-1基因cDNA的一段270bp的保守序列进行Blast检索(tblastn)。发现水稻的3号染色体上有两个串联排列的与玉米In2-1基因同源的基因,OsGSTZ1和OsGSTZ2。半定量RT-PCR分析和Nothem blot分析表明:OsGSTZ1在水稻中呈组成型表达;OsGSTZ2在水稻根中的表达受绿磺隆的诱导,而在水稻叶中的表达不受绿磺隆的影响,且OsGSTZ2在水稻根和叶的表达都不受脱落酸、乙烯利和茉莉酸甲酯的影响。 OsGSTZ1基因由9个外显子和8个内含子组成,该基因的编码序列为732 bp,编码243个氨基酸;OsGSTZ2基因由10个外显子和9内含子组成,基因的编码序列为735 bp,编码244个氨基酸。这两个基因编码区的核苷酸同源性为76.87%,编码蛋白的氨基酸一致性为68.85%,是两个高度同源的基因。将其氨基酸序列经Blast检索(blastP)和功能区分析,发现它们都属于谷胱甘肽转移酶。 OsGSTZ1和OsGSTZ2基因在酵母中得到表达,体外活性检测表明转化OsGSTZ1和OsGSTZ2基因的酵母,其总谷胱甘肽转移酶活性是未转基因酵母的7—8倍,它们编码的蛋白具有典型的GST活性。 克隆到OsGSTZ2基因起始密码子ATG上游的2,171 bp的序列,OsGSTZ2启动子在转录的起始位点附近没有典型的TATA-box。5’端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得不同长度的启动子与GUS融合的转基因载体GSTZ2171::GUS,GSTZ1761::GUS、GSTZ962::GUS和GSTZ525::GUS。基因枪法转化洋葱表皮细胞,这些转基因载体都能在洋葱表皮细胞中启动下游GUS报告基因的表达。在转基因水稻植株中,通过组织染色可见GUS报告基因在种子、不同生长时期的叶和早期幼苗的根部都有表达:但在生长后期的水稻根部,只有GSTZ525::GUS转化的水稻中有GUS基因的表达,说明可能有不同的调控元件控制基因的表达。GUS活性分析表明:在-525 bp—-1 bp和-1761 bp—-962 bp有增强基因表达的元件,而在-962 bp—-525 bp的范围内存在抑制基因表达的元件。随着幼苗的生长,幼苗的根和叶的GUS活性逐渐减弱,在-525 bp—-1 bp范围内存在有随着植物生长而基因表达衰减的元件。绿磺隆、SA和NAA能诱导GUS基因在根中的表达,诱导元件在-962 bp—-525 bp的范围内。草甘膦也能诱导GUS基因在根中的表达,但诱导元件在.1761 bp—-962 bp的范围内。-1761 bp—-1 bp是一个完整的启动子。OsGSTZ2启动子对ABA、盯和MeJA没有应答反应。 将OsGSTZ1和OsGSTZ2基因分别转化水稻,PCR和Southern b10t分析表明这两个基因都能转化水稻并稳定遗传,real-time RT-PCR和Western blot分析表明这两个基因在转基因水稻中得到过量表达,转基因水稻的谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性都显著提高。转基因水稻的过氧化物含量降低。转基因水稻抗性分析表明OsGSTZ1和OsGSTZ2编码的蛋白具有解绿磺隆和草甘膦毒性的功能。 半定量RT-PCR分析表明:OsNRT1.1在水稻的根和叶中的表达都受干旱的诱导。分离到OsNRT1.1读码框上游的2,019 bp序列,序列分析表明该序列具有典型的启动子结构特征,在起始密码子ATG上游189 bp和127 bp处分别有推测的CAAT-box和TATA-box存在。OsNRT1.1启动子5’端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得重组子NRT2019::GUS、NRT1196::GUS和NRT719::GUS。将以上重组子分别转入洋葱表皮细胞,均能启动下游GUS报告基因的表达。转入NRT2019::GUS、NRT1196::GUS和NRT7l9::GUS的水稻植株的种子、根、叶和花中都检测到GUS的表达,且表达程度没有明显差异。紧急干旱和模拟干旱能诱导GUS基因在水稻中的表达,可将GUS基因的表达量提高到3倍左右,且干旱应答元件在-719 bp—-1bp的范围内。OsNRT1.1启动子对ABA、NaCl、(NH_4)_2So_4、KNO_3和GIn没有应答反应。


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