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基于食品蛋白和天然多糖的生物大分子自组装

喻绍勇  
【摘要】:自组装是指分子或者分子的一部分自发地形成有序结构的过程。经过多年的发展,自组装已经在众多的合成高分子体系中取得成功。现在有越来越多的研究开始利用生物高分子在体外进行组装。生物高分子可以利用特有的相互作用如蛋白质的特异性相互作用、DNA的碱基互补等进行组装。在众多的生物高分子组装体系中,没有特异性相互作用的球状蛋白之间的组装较少有文献涉及。虽然现在已经有利用单一的球状蛋白在特定的变性条件下通过静电相互作用和疏水相互作用得到纤维状组装体的报道,也有利用交联剂制备蛋白质微球的报道,但限于操控天然球状蛋白分子之间的非共价键相互作用的复杂性,到目前为止,还没有见到利用天然的、没有特异性相互作用的球状蛋白分子自组装制备纳米凝胶的报道。蛋白质,尤其是食品中的蛋白质,本身是一类营养物质,无毒,可以食用,具有良好的生物相容性,在消化系统内可以被降解,很适合于作为口服药物载体。因此,利用食品蛋白质进行自组装,不仅具有研究价值,而且具有应用前景。 本论文的工作主要集中在利用天然高分子,包括球状和链状的食品蛋白质、天然的带电荷和不带电荷的多糖进行自组装,得到生物大分子胶束或者生物大分子微凝胶。文中首次提出了一种方便的利用一对带相反电荷的蛋白质,或者利用带相反电荷的蛋白质和多糖进行组装制备微凝胶的方法,并在多个体系中取得成功。我们所实现的上述生物大分子组装,与线性合成高分子的自组装,以及传统的利用蛋白质之间的特异性相互作用引起的组装均有很大的不同。我们所发展的利用食品蛋白质和天然多糖制备微凝胶的方法简单易行,除pH调节所需要的酸和碱以外,在制备过程中不加入其他化学物质,因而所得到的微凝胶无毒、生物相容、可生物降解、可以食用,适合于作为药物载体。具体来说,本论文包括了以下三个部分的工作: 第一部分是利用两种等电点不同的食品蛋白质通过加热变性进行自组装制备纳米微凝胶。白蛋白和溶菌酶都是鸡蛋清中的蛋白质,其中,白蛋白的等电点在4.8而溶菌酶的等电点在10.7。我们发展的方法如下:在弱酸性溶液中混合这两种蛋白质,此时二者的相互作用不是很强;然后调节溶液pH到溶菌酶的等电点附近,在这过程中,二者先是形成静电络合物,接着静电络合物发生分子重排,溶菌酶分子因为其静电荷趋于零而倾向于聚集,白蛋白分子因为带有较多的负电荷而倾向于互相远离;再加热溶液,使两种蛋白质变性以形成分子间的疏水作用和二硫键,即可得到稳定的纳米粒子。文中我们对这两种蛋白质通过加热变性进行自组装的条件进行了详细的研究,找到了最佳的制备条 件。并用AFM和TEM观察了所制备的纳米粒子的形貌。结合球状蛋白自身的性质和光散射研究的结果我们判断出所制备的球形纳米粒子是一种微相水凝胶,即球状蛋白的微凝胶。然后,我们又用ζ电位、离心超滤分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法确定了凝胶粒子的核壳结构,其核是由变性的溶菌酶分子和一小部分变性的白蛋白分子所构成,而壳层则主要由变性的白蛋白分子构成。所形成的凝胶粒子能可逆、稳定地分散在pH小于4和大于6.3的溶液中。而在白蛋白的等电点附近,由于凝胶粒子表面所带的电荷趋于零而形成二次聚集体。为了解决此问题,我们用安全、无毒、在自然界中自然发生的Maillard反应,将葡聚糖的末端羟基与白蛋白分子表面的赖氨酸进行偶联,然后将接有葡聚糖的白蛋白与溶菌酶进行组装,得到了在白蛋白等电点也能稳定分散的纳米凝胶。根据对以上自组装形成纳米凝胶机理的理解,我们发展了一种通用的利用一对带相反电荷的蛋白质进行组装制备微凝胶的方法,并在多个体系中取得成功。 第二部分是利用壳聚糖和白蛋白制备pH敏感的纳米水凝胶。在前一个体系成功的基础上,我们选择了在生物医学领域应用广泛的壳聚糖和白蛋白分子进行组装。壳聚糖是唯一一种天然的阳离子型多糖,具有抗菌、生物相容、抗肿瘤等多种作用,在酸性条件下可以质子化而溶于水。将壳聚糖和白蛋白在酸性溶液以适当的比例混合后并调节混合溶液的pH到适当值,然后加热使白蛋白变性即可得到稳定的凝胶粒子。我们对制备条件进行了较为详细地探讨,得到了优化的制备方案。SEM和TEM观察表明凝胶粒子具有一定的核壳结构。通过对凝胶粒子ζ电位的研究,并结合凝胶粒子的溶解性质,我们认为凝胶粒子的外层是由伸展的壳聚糖链所构成,而白蛋白和被冻结在白蛋白微凝胶网络中的壳聚糖链,共同构成了凝胶粒子的内核。通过动态光散射的研究,我们发现所制备的微凝胶粒径由于凝胶粒子电荷的变化而具有pH敏感性。最后,以芘作为疏水荧光探针,我们发现所制备的凝胶粒子在不同的pH环境下具有不同的亲/疏水性。 第三部分是利用葡聚糖接枝的β-酪蛋白实现了对活性物质溶菌酶分子的包埋和释放,发现释放出的溶菌酶分子完全保留了其生物活性。β-酪蛋白是牛奶蛋白中的一种组分,是一种线性的蛋白质分子,等电点是pH4.8。通过Maillard反应将分子量35kDa的葡聚糖分子接枝到β-酪蛋白上制备了全水溶性的接枝聚合物。当把溶菌酶的水溶液滴加到上述接枝共聚物的水溶液中,并调节溶液的pH至某一合适值,即可得到以β-酪蛋白和溶菌酶的静电络合物为核、酪蛋白上接枝的葡聚糖为壳的胶束。在一定的酸、碱或盐的条件下,溶菌酶还可以从胶束中释放出来。对微球菌裂解的实验表明释放出的溶菌酶分子具 有和单独的溶菌酶分子相同的活性。我们还研究了加入Ca~(2+)离子对胶束稳定性的作用。当使用疏水性更强、含有更多磷酸基团的酪蛋白代替β-酪蛋白时,发现所制备的胶束在酸、碱、盐条件下的稳定性有所增加。


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