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基于ITS序列的柴胡属植物系统学探讨及三种柴胡属植物种间差异比较蛋白质组表达谱的初步研究

谢晖  
【摘要】: 中药柴胡为我国常用中药,在我国的使用已具有二千多年的历史。本论文首先对其历史沿革进行了本草考证及资料整理,在此基础上提出:现阶段应结合柴胡属植物野生资源状况,扩大《中华人民共和国药典》收录品种;将柴胡分为主要用药部位为根的“北方柴胡类”和使用全草入药的“南方柴胡类”,分别建立药效评价系统,找出可准确用于质量评价的物质基础,制定能有效进行质量控制的标准;并积极探索人工繁育系统,以缓解野生资源压力,使我国柴胡资源进入可持续发展的良性循环当中。同时,本论文对中药柴胡的资源学研究内容进行了概述,结果表明国内外对于柴胡属植物的研究已有相当深度和广度,同时柴胡属植物具有丰富的种质资源和遗传多样性,因而适宜作为多种次生代谢产物生物合成途径以及相关蛋白质与基因系统研究的模式植物加以研究。 其次,中药柴胡的基源植物及其同属植物——柴胡属植物全世界大约150多个种,主要有两大分布中心,一为地中海沿岸地区,主要为欧洲西南部和非洲西北部;另一为中国境内大部分地区,主要为西北部和西南部,包括42种,17变种,7变型,其中中国特有的柴胡有25种,15变种,7变型。本论文采用柴胡属及其近源植物70种(74 taxa)的90条核核糖体DNA ITS序列(其中27条为本研究获得),结合形态学、细胞学、花粉形态、解剖学、植物化学等前人研究成果,探讨了柴胡属植物的起源与进化及本属与属下系统。主要结果有:(1)柴胡属植物为单起源类群,此结果与前人广泛接受之观点相一致;(2)支持潘胜利(2002)将柴胡属从芹亚科(Apioideae)分出,并成立仅具单属的柴胡亚科(Bupleuroideae);(3)支持将柴胡属分为Penninervia和Bupleurum两个亚属,建议Bupleurum亚属分为四个类群。(4)分布或栽培于日本和朝鲜半岛的柴胡属植物因与分布于欧洲的B.falcatum存在较大分歧,不适于使用B.falcatum对其命名,支持将其命名改为B.stenophyllum(Nakai)Kitagawa及其变种B.stenophyllum(Nakai)var.kiusianum Kitagawa.的观点。 同时,本论文比较研究了中国柴胡属药用植物rDNA ITS序列的差异和规律。结果显示ITS序列与外类群ITS序列间比对同源性均小于75%,属内序列间两两比对同源性均大于87%,大于99%可作为鉴定指标。因而ITS序列作为中国柴胡属药用植物鉴定形状具有一定实用性和可靠性。 再次,本论文建立了适合于不同生长时期的多年生柴胡属植物根材料的双向电泳样品制备方法,尤其是针对含有大量干扰物质的多年生花果期柴胡属植物根材料进行了积极的探索,并成功地建立了一种新的方法。此新方法的创新之处在于: 使用提取缓冲液提取组织材料,提取液加入水饱和的氯仿/异戊醇(24/1,V/V)使溶液形成中间固体层、有机相和水相,蛋白质依据各自极性分配其中。与此同时,核酸及其它水溶性干扰成分分配入水相,而相对亲脂性的干扰成分进入有机层。此后,使用不同的方法分别从此三相中提取蛋白质,三部分蛋白质总得率为1.41 mg/g。使用此方法制备的蛋白质样品进行双向电泳,所得图谱背景清晰,蛋白质点分离效果良好,可有效分离蛋白质点3662个。此方法在国内外尚未见报道,其在其它植物中的适用性有待进一步的扩展研究。而利用此新方法对三种柴胡属植物进行的种间差异比较蛋白质组表达谱的初步研究,目前已从229个差异蛋白质中成功鉴定出94个已知蛋白质。该结果将为进一步开展对柴胡属植物在皂苷类有效成分生物合成途径及相关基因和蛋白质的系统研究奠定有利的基础,也为进行柴胡属植物次生代谢产物生物合成途径的系统研究建立了新方法,积累了新数据。此部分内容的研究结果目前在国内外尚未见报道,属于国际首创。


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