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生长因子受体结合蛋白10对Bim介导的细胞凋亡影响的研究

张佳忆  
【摘要】: 在多细胞生物中,凋亡是一种正常的生理过程,该过程清除了多余的细胞,确保了胚胎发育和组织分化的完成,维持了体内细胞数量的动态平衡。细胞内线粒体凋亡途径是凋亡的主要途径之一。线粒体途径是由促凋亡和抗凋亡Bcl-2蛋白家族蛋白调控。Bim属于BH3-only促凋亡蛋白,其首先被发现于和Bcl-2结合的蛋白中。到目前为止,至少有11种Bim的异构体被报道。Bim EL、Bim L和Bim S可以与位于线粒体外膜的Bcl-2及Bcl-XL结合,从而激发了细胞色素C的释放,进而引起细胞凋亡。Bim EL和Bim L可以与动力马达蛋白复合体的动力蛋白轻链LC18结合,这种结合抑制了它们的促凋亡活性。当外界应激激活JNK途径时,结合于细胞骨架上的Bim被磷酸化并从骨架上脱落激活。Bim S缺少可与动力蛋白结合的结构域而具有更潜在的细胞毒性。已经证实的能够结合于Bim启动子上的转录因子有FoxO3(FKHRL1)、Myb和RUNX3。当外界刺激能够激活Rb时,其下游的E2F则结合于Bim的启动子,同样启动其转录。TGF-β能通过Smad3来上调Bim的表达,同时TGF-β还能导致RUNX3结合于Bim的启动子来上调Bim的转录。对Bim的翻译后调控主要集中在JNK对Bim的磷酸化。此外Mcl-1与Bim的相互作用也能阻止Bim的诱凋亡作用。最近研究表明Bim还可通过蛋白质降解途径得到控制。通过被活化的ERK1/2磷酸化Bim EL的丝氨酸而导致Bim被蛋白酶体降解。 我们的实验以pLexA-Bim L为bait,用酵母双杂交的方法对胎脑pB42AD文库进行筛选以找出与Bim L相互作用的蛋白。在11个重复2次或2次以上的阳性克隆中,我们重点对生长因子受体结合蛋白10(Grb10)进行了深入研究。通过生物信息学分析和多组织RT-PCR分析发现,在16种成人正常组织中,Grb10是广泛表达的,尤其是在胰岛素靶组织如:胰腺和骨骼肌中表达量最高,提示其在胰岛素信号通路中起一定作用。在Bim L和Grb10的亚细胞共定位实验中,我们发现过量表达的Bim L在短时间内以点状分布于胞质中,一定时间后会扩散至整个细胞。而Grb10主要集中在细胞核周围,与线粒体的分布相似。但通过线粒体特异性染料Mito-tracker对线粒体进行染色后,我们发现Grb10和线粒体部分重叠,提示在过量表达情况下,Grb10很可能位于线粒体及其周围质膜以及胞质中。而GFP-Bim L与Grb10-RFP有部分重叠,说明在空间上两者也有相互作用的可能。利用免疫共沉淀实验,我们确定了Bim L能与Grb10结合,提示了Grb10在Bim L参与的凋亡途径中可能有一定的作用。细胞凋亡实验结果表明,在Grb10过量表达的情况下,由Bim L介导的细胞凋亡会在一定程度上得到抑制。因为Grb10中的SH2结构域可以与磷酸化的酪氨酸受体特异性结合,我们根据Bim L蛋白序列中可能进行磷酸化的酪氨酸位点进行了定点突变。但细胞凋亡检测发现,发生酪氨酸点突变的Bim L所诱导的凋亡被Grb10抑制的效果没有受到明显影响,说明Grb10与Bim L的结合可能通过其它方式和/或部位进行。为进一步寻找Grb10与Bim L的相互作用区域,我们对Grb10对Bim L的不同异构体Bim S、Bimα2及Bimα3诱凋亡的抑制作用进行了比较,发现Grb10对Bim S和Bimα3无明显抑制效果,对Bimα2有一定抑制作用。根据Bim L及其异构体的结构域组成特点,实验结果提示Grb10可能是通过DBD结构域与Bim L结合。在磷酸化位点预测中,Bim L蛋白的Ser44和Thr56丝氨酸和位于该结构域中,我们分别检测了Grb10对Ser44和Thr56点突变Bim L的抑制作用,结果无明显抑制,实验结果提示Grb10与Bim的相互作用与这两个位点可能有关。但由于这两个位点可能与ERK1/2和JNK的磷酸化有关,还需进行更深入研究来阐明这两个位点在Grb10与Bim L的结合中的角色。 此外,为进一步寻找Grb10在胰岛素受体和生长因子受体途径之外的重要靶标和配体,我们以pLexA-Grb10为bait,用酵母双杂交的方法对胎脑pB42AD文库进行筛选,我们发现与Grb10可能有相互作用的蛋白在细胞中的作用基本上都与促进细胞增殖或阻止细胞凋亡有关。TCTP可调节Tsc-Rheb信号途径,促进细胞增殖和防止凋亡;PSMA可协助磷酸化的Bim降解;ProTα阻止凋亡体的形成,负向调控caspase-9的活性,从而抑制细胞凋亡产生癌变。 Grb10与Bim L具有相互作用提示Grb10除了在胰岛素受体途径中的作用还参与由Bim介导的细胞凋亡信号途径,并且Grb10也有可能参与对Bim的调节。Grb10与Bim家族蛋白之间相互作用的生物学功能还有待深入研究,本文的实验结果首次提出Grb10在Bim参与的细胞凋亡中具有一定的作用,为进一步阐明凋亡机制提供了有益的线索。


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