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孕三烯酮微球治疗子宫肌瘤药效学研究及作用机制探讨

朱焰  
【摘要】: 目的: 研究孕三烯酮微球对实验性豚鼠子宫肌瘤的治疗效果及对体外培养子宫肌瘤细胞的影响,探讨孕三烯酮治疗子宫肌瘤可能涉及的相关机制。 方法: 1.单次给予孕三烯酮微球注射液后,考察食蟹猴体内孕三烯酮血药浓度的变化。 2.选用动情周期规则的大鼠,单次皮下注射孕三烯酮微球后,阴道涂片,观察孕三烯酮对SD大鼠性周期的影响,确定孕三烯酮是否具有长效作用。 3.采用去势雌性豚鼠,外源性给予雌激素(E_2)(50或100μg/只,每周2或3次,分别于第8、12和16周时解剖动物,观察子宫形态变化,计算子宫脏器系数,子宫组织切片,HE染色,进行病理组织学检查,建立适宜的豚鼠子宫肌瘤模型。 4.利用外源性E_2诱导的子宫肌瘤模型,于第7~16周皮下注射孕三烯酮微球2、4和8mg/kg,每10天一次,给药10周后处死动物,解剖观察子宫形态变化,计算子宫脏器系数;子宫组织切片,HE染色,进行病理组织学检查,观察孕三烯酮微球对豚鼠子宫肌瘤模型的影响;测定动物体内雌激素(E_2)和孕激素(P)水平。 5.利用人子宫肌瘤组织和瘤旁肌层组织,采用胶原酶消化,体外培养人子宫肌瘤和肌层细胞,并建立子宫肌瘤有限细胞系,考察孕三烯酮对剥夺E_2子宫肌瘤细胞的影响。 6.利用外源性E_2诱导的子宫肌瘤模型和剥夺E_2子宫肌瘤细胞,运用免疫组化、Westernblot和实时荧光定量RT-PCR,考察正常子宫和肌瘤中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、磷酸化雌激素受体(Phospho-~(167)ER)以及磷酸化孕激素受体(Phospho-~(190)PR)的表达差异,并研究孕三烯酮在外源性E_2存在和不存在情况下对ER、PR、Phospho-~(167)ER以及Phospho-~(190)PR表达的影响。 7.研究孕三烯酮对外源性E_2诱导的子宫肌瘤和剥夺E_2子宫肌瘤细胞周期和凋亡的影响。 8.采用人肿瘤信号转导通路基因芯片测定子宫肌层和肌瘤细胞中的基因表达,比较子宫肌层和肌瘤细胞中差异表达的基因,筛选影响肌瘤形成的信号传导通路,考察孕三烯酮对子宫肌瘤细胞信号转导通路基因芯片中基因表达的影响。 9.利用外源性E_2诱导的子宫肌瘤模型和剥夺E_2子宫肌瘤细胞,运用免疫组化、Westernblot和实时荧光定量RT-PCR方法,考察正常子宫和肌瘤中酪氨酸激酶(c-Src)以及磷酸化酪氨酸激酶(Phospho-~(416)Src)的表达差异,研究孕三烯酮在外源性雌激素存在和不存在情况下对c-Src以及Phospho-~(416)Src表达的影响。 10.运用免疫沉淀方法初步考察ER/c-Src的相互作用,初步探讨孕三烯酮对ER/c-Src的相互作用的影响。 结果: 1.食蟹猴单次皮下注射给予孕三烯酮微球注射液0.6、2和6mg/kg,给药30分钟后即可达血药浓度高峰,释放时间为约490小时,有效浓度可维持约350小时。 2.SD大鼠单次皮下注射孕三烯酮微球3.5、7.0和14.0mg/kg后,动情间期持续时间延长,连续2周抑制排卵。 3.双侧摘除卵巢、性成熟的雌性豚鼠,皮下注射E_2 100μg/只,2次/周,连续12周后,豚鼠子宫增生、膨大,形态明显改变,部分动物子宫有肉眼可见的肌壁间瘤和浆膜下肌瘤形成;并伴有继发性改变。病理组织学检查可见,增生的子宫肌细胞呈长梭形,编织状或栅状排列,细胞核呈短棒状或卵圆形,显示明显的子宫肌瘤特征,与人子宫肌瘤病理组织学特征相似。 4.利用E_2诱导的豚鼠子宫肌瘤模型,皮下注射给予孕三烯酮微球注射液2、4和8mg/kg,1次/10天,连续10周后,可见子宫增殖程度较轻,肉眼未见肌瘤形成;与模型组相比,子宫重量和脏器系数显著降低(P<0.05),病理检查显示肌细胞排列接近正常对照组。在4和8mg/kg时,孕三烯酮微球以剂量依赖性方式抑制血清E_2浓度。 5.孕三烯酮可明显抑制剥夺E_2的子宫肌瘤细胞的生长。IC50值为26.7μmol/L。 6.剥夺E_2的肌瘤细胞中ERmRNA和PR mRNA水平低于瘤旁子宫肌层细胞,但二者的蛋白水平和磷酸化蛋白水平高于瘤旁子宫肌层细胞。肌瘤细胞中ER和PR的磷酸化修饰可以不依赖E_2。 7.在外源性E_2存在时,孕三烯酮(2、4和8 mg/kg)可下调ER、PR和PRB的表达。在剥夺E_2的子宫肌瘤细胞中,在转录水平:孕三烯酮0.1,1和10μmol/L可使肌瘤细胞中PRmRNA、ERβmRNA和ERαmRNA呈下调趋势;较高剂量(10μmol/L)时ERαmRNA下调趋势更明显,而ERβmRNA水平则呈上调趋势。在蛋白水平:孕三烯酮(0.1,1和10μmol/L)以剂量依赖性方式下调ER、PR及其磷酸化蛋白Phospho-~(167)ER和Phospho-~(190)PR的表达。 8.在E_2诱导的豚鼠子宫肌瘤组织,孕三烯酮2、4和8mg/kg组细胞凋亡率与模型组和正常对照相比未见明显变化(P>0.05);在剥夺E_2的子宫肌瘤细胞,孕三烯酮对子宫肌瘤细胞凋亡率的影响与溶剂对照组相似。RU486可明显促进细胞凋亡。 9.与瘤旁子宫肌层细胞基因表达谱相比,在肿瘤信号转导涉及的15条通路96个被测基因中,子宫肌瘤细胞基因表达谱中22条基因明显上调,25条基因明显下调,上调的差异基因主要涉及的信号通路包括:低氧通路、炎症通路(NF-κB通路和Cox-2通路)、STAT通路、WNT通路、雄激素通路和Hedgehog通路;而雌激素通路、抗细胞增殖通路(TGFβ通路)及与凋亡相关的细胞幸存(PI3K/AKT)通路和DNA损伤/p53通路相关的基因水平变化较小。 10.给予孕三烯酮3μmol/L作用36小时后,子宫肌瘤基因表达谱中,下调11条基因明显上调,46条基因明显下调,下调基因主要涉及炎症通路(NF-κB通路)、激素通路(雌激素与雄激素通路)、低氧通路、WNT通路、Hedgehog通路、STAT通路、Wint通路和抗细胞增殖通路(TGFβ通路)。而与凋亡相关的细胞幸存(PI3K/AKT)通路、DNA损伤/p53通路、热激通路和p38/JNK通路的相关基因水平变化较小。 11.免疫组化结果显示,在正常子宫肌层细胞,c-Src阳性表达部位在细胞浆和细胞核周;在子宫肌瘤细胞,c-Src阳性表达部位在细胞核。在E_2诱导的子宫肌瘤模型中,模型组豚鼠子宫肌细胞c-Src的阳性表达率明显高于正常对照组(p<0.05),孕三烯酮2、4和8mg/kg组c-Src的阳性表达率降低(p<0.05)。给予孕三烯酮0.1~1μmol/L后,细胞核着色淡,阳性反应程度和反应率降低。 12.在转录水平,剥夺E_2的肌瘤细胞中c-Src mRNA含量高于瘤旁子宫肌层细胞,孕三烯酮0.1~10μmol/L可以剂量依赖性方式降低肌瘤细胞中c-Src mRNA表达。 13.蛋白水平:在E_2诱导的豚鼠子宫肌瘤组织,c-Src和phospho-~(416)Src蛋白含量明显高于正常对照组(P<0.05),孕三烯酮2~8mg/kg可明显下调c-Src和phospho-~(416)Src蛋白表达;在剥夺E_2的子宫肌瘤细胞,c-Src mRNA蛋白含量明显高于瘤旁子宫肌层细胞(P<0.05),孕三烯酮0.1~10μmol/L可以明显降低肌瘤细胞中c-Src和phospho-~(416)Src蛋白表达(P<0.05)。 14.初步的免疫沉淀结果提示,在子宫肌瘤细胞中存在ER/c-Src的相互作用,孕三烯酮0.1和1μmol/L可能抑制ER/c-Src的相互作用。 结论: 1.性成熟的雌性豚鼠,双侧摘除卵巢后,皮下注射E_2100μg/只,2次/周,连续12~16周,可成功建立豚鼠子宫肌瘤动物模型。 2.孕三烯酮微球具有长效缓释作用。 3.皮下注射孕三烯酮微球注射液在2、4和8mg/kg时以剂量依赖性方式抑制E_2诱导的豚鼠子宫肌瘤形成,孕三烯酮的抗子宫肌瘤作用部分与其较强的抗雌激素作用有关。 4.在剥夺E_2的子宫肌瘤细胞,孕三烯酮可明显抑制子宫肌瘤细胞的生长,IC50值为26.7μmol/L。 5.首次发现,在剥夺E_2的肌瘤细胞,ER和PR的磷酸化修饰可以不依赖雌激素。孕三烯酮可在蛋白水平下调ER、PR及其磷酸化水平,在转录水平以不同方式调节ERmRNA和PRmRNA的表达。在外源E_2存在时,孕三烯酮可下调ER、PR和PRB的表达。 6.无论是否存在外源性E_2,孕三烯酮均无明显诱导肌瘤细胞凋亡的作用,与RU486作用机制不完全相同。 7.子宫肌瘤的形成可能与低氧、炎症、有丝分裂以及磷酸化信号通路活跃有关。首次发现,孕三烯酮可通过影响炎症、低氧、激素、有丝分裂以及磷酸化相关信号通路阻止肌瘤细胞增殖,而与细胞凋亡关系较小。 8.首次发现,酪氨酸激酶c-Src的表达可能与子宫肌瘤形成有关,c-Src的高表达与可以不依赖于E_2,但子宫肌瘤细胞中c-Src活性与E_2有关。在子宫肌瘤发展的进程中,c-Src可能从胞浆向核内移位。孕三烯酮可在转录水平和蛋白水平下调c-Src的表达,降低其磷酸化水平,使c-Src活性降低。 9.在子宫肌瘤细胞中存在ER/c-Src的相互作用,孕三烯酮对子宫肌瘤的抑制作用可能与抑制ER/c-Src相互作用有关。


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