大鼠骨髓间充质干细胞诱导同种异体心脏移植免疫耐受

【摘要】： 器官移植的治疗目的是向人体引入异体的细胞、组织或器官，从而代替丧失相应功能的细胞、组织或器官，并使受体接受，不被机体免疫系统排斥，而且移植物也不排斥宿主。目前器官移植术后，受体多须终身使用免疫抑制剂，降低受体的全身免疫功能，减少或抑制受体对移植物的免疫排斥反应以达到维持移植物长期存活的目的。但是长期使用用免疫抑制剂导致感染和肿瘤高发，而且各种免疫抑制剂药物的毒副作用影响受体的生存质量，严重者甚至导致慢性移植物功能衰竭的发生。此外，即使受体长期服用并能耐受免疫抑制剂，移植物长期存活率也并不理想。诱导受体对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施。也就是说在长期不使用免疫抑制剂的情况下，移植物既不被受体排斥，发生宿主抗移植物反应；同时也不致发生移植物抗宿主反应，但是仍保留对除移植物以外的正常免疫应答。 间充质干细胞是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最丰富。间充质干细胞具有多向分化能力，可以分化为骨、软骨、脂肪等；具有较低的免疫原性，在体内可以逃避免疫系统的攻击；同时发现具有免疫调节作用，可以抑制同种异体T细胞增殖，研究表明间充质干细胞可以延长皮肤移植物的存活时间，减少移植物抗宿主病的发生。近来对间充质干细胞免疫调控功能的研究，提示其在诱导器官移植免疫耐受中的应用前景。本研究从大鼠骨髓中分离出间充质干细胞，建立大鼠同种异位心脏移植模型，旨在研究骨髓间充质干细胞在心脏移植中诱导免疫耐受，减少免疫排斥的作用，并探讨其可能机制。本研究分为四部分。 第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定 第二部分大鼠骨髓间充质干细胞对同种T细胞的作用及其机制 第三部分大鼠同种异体心脏移植模型的建立 第四部分大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体心脏移植的作用及其机制 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定 【目的】探讨体外分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法，并分析其表型特点；评价大鼠骨髓间充质干细胞进行同种异体移植的安全性。 【方法】用密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，，形态学观察，流式细胞仪分析测定细胞表面抗原，DAPI标记。20只Wistar大鼠，体重200—250g。随机分为2组：A空白对照组，B MSCs移植组。观察移植术后大鼠一般情况，术后7天处死取骨髓涂片，免疫荧光镜下观察。 【结果】MSCs是骨髓细胞中的单个核细胞，密度梯度离心法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含10％胎牛血清的L-DMEM中生长性状相对稳定，细胞呈均一的成纤维细胞样，均一表达CD90，不表达CD34、CD45。MSCs移植组可以长期存活，术后7天骨髓涂片可见存活的MSCs。 【结论】本实验建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法，MSCs稳定表达CD90，不表达CD45、CD34；同种异体来源的MSCs可在宿主体内存活、定居，并未发生免疫排斥。 第二部分大鼠骨髓间充质干细胞对同种T细胞的作用及其机制 【目的】探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在混和淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞免疫应答反应的影响，并初步探讨其作用机制。 【方法】建立MSCs和同种异体淋巴细胞共培养体系，反应体系总量250μl。以SD大鼠的脾T淋巴细胞为刺激细胞，以Wistar大鼠的脾T淋巴细胞为反应细胞，分为6组。组Ⅰ：对照组，1×10~5／50μl刺激细胞和1×10~5／50μl反应细胞共同培养；组Ⅱ：1×10~5／50μl反应细胞与1×10~4／50μl SD大鼠的MSCs共同培养；组Ⅲ：1×10~5／50μl刺激细胞和1×10~5／50μl反应细胞并加入1×10~4／100μl SD大鼠的MSCs共同培养；组Ⅳ：细胞种类及数量同第三组，另加1-甲基色氨酸(1—MT)(终浓度1mmol／ml)；组Ⅴ：细胞种类及数量同第三组，另加植物刺激素(终浓度2μg／ml)；组Ⅵ：每孔加入反应细胞和刺激细胞各50μl(各含细胞数1×10~5个)及MSC0.01ml(含细胞数1×10~3个)。混合培养120小时，结束培养前13小时，每孔加入~3H-TdR 20ul，以液闪测定仪测定各组的CPM值。反相高效液相色谱法检测MSC和MLR共培养体系中色氨酸含量。 【结果】MSCs可以抑制MLC体系中T淋巴细胞增殖，并呈现出剂量依赖关系；同时MSCs和MLR共培养体系中色氨酸含量明显降低。1-MT可以阻断这一作用。 【结论】MSCs在体外可抑制同种异体T淋巴细胞的免疫应答，IDO参与了这种免疫抑制作用。 第三部分同种异体大鼠异位心脏移植模型的建立 【目的】以改良Ono法进行大鼠腹部心脏移植，建立动物模型。 【方法】以体重200～250gSD大鼠为供体，体重200～250g的Wistar大鼠为受体，进行大鼠腹部异位心脏移植手术。SD大鼠经麻醉、肝素化后，打开胸腔，阻断主动脉，经主动脉根部灌注心肌保护液，将供体的心脏取下。Wistar大鼠麻醉后，打开腹腔，将供体的主动脉与受体的腹主动脉行端侧吻合，将供体的肺动脉和受体的下腔静脉行端侧吻合。 【结果】大鼠异位心脏移植模型成功率达100％。总手术时间约60～75min，平均(70.1±4.9min)；供心摘取时间约8～12min，平均(10.5±2.3min)；受体准备时间约11～15min，平均(13.7±2.0min) 【结论】改良Ono法进行大鼠腹部心脏移植模型可靠易行，可重复率高 第四部分大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体心脏移植的作用及其机制 【目的】研究静脉输注骨髓间充质干细胞(MSCs)对心脏移植术后急性排斥反应的影响及其机制。 【方法】64只Wistar大鼠随机分成4组，每组16只，作为受体。组Ⅰ：空白对照组经腰静脉注射PBS；组Ⅱ术中经腰静脉注射供体大鼠骨髓间充质干细胞1×10~6／ml；组Ⅲ术后7天每天使用环胞霉素5mg／Kg；组Ⅳ术中供心经腰静脉注射供体大鼠骨髓间充质干细胞1×10~6／ml，术后7天每天使用环胞霉素5mg／Kg。观察各组供心存活时间；术后七天取供心，观察病理改变，并取脾脏细胞悬液流式细胞仪检测CD4~+、CD8~+的百分比，计算并比较各组CD4~+／CD8~+的比值，ELISA法检测外周血细胞因子干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素—10(interleukin-10，IL-10)水平。 【结果】移植心脏的存活时间为组Ⅰ：7.5±0.9天；组Ⅱ：15.5±1.6天；组Ⅲ：17.3±1.3天；组Ⅳ：33.4±3.2天。统计学分析显示，移植心脏存活时间组Ⅱ比组Ⅰ明显延长(p＜0.05)，组Ⅳ比其它三组明显延长(P＜0.01)。组Ⅳ移植心脏病理改变较其它三组为轻。受体外周血CD4／CD8比例，组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均高于组Ⅰ(P＜0.05)；组Ⅳ与其它三组相比亦明显增高(P＜0.05)。受体血清IFN-γ水平，组Ⅱ、Ⅲ明显低于组Ⅰ，组Ⅳ低于其他三组(P＜0.05)。血清IL-10水平，组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均高于组Ⅰ(p＜0.05)，组Ⅳ高于组Ⅰ和组Ⅱ(P＜0.05) 【结论】骨髓间充质干细胞可减轻大鼠同种异体移植心脏的免疫排斥反应并延长移植心脏的存活时间。其机制可能与调节同种异体T细胞功能和细胞因子分泌有关。环胞霉素A与骨髓间充质干细胞联合应用抑制免疫排斥反应有协同作用。