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新基因—代谢相关蛋白基因的克隆、功能研究及黄芪多糖对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞功能的影响

杨志红  
【摘要】: 第一部分人代谢相关蛋白的蛋白表达与功能的初步研究 目的克隆和表达人代谢相关蛋白(MRP)基因,初步揭示MRP的功能。 方法RT-PCR克隆MRP基因全长,将MRP基因构建到原核表达载体pPROEXHTa与真核表达载体pEGFP—C3,在E.col ROSSET(DE3)菌中高效表达并纯化MRP融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;利用激光共聚焦显微镜观察MRP在HEK293细胞中的定位。利用RT-PCR与Western Blot技术观察了MRP基因和蛋白表达谱,利用免疫荧光组化和激光共聚焦显微镜观察到MRP在胰岛细胞中的表达及定位。制备MRP Northern Blot探针。建立人脂肪细胞原代培养方法,利用RT-PCR技术观察不同浓度葡萄糖不同时间作用人脂肪细胞MRP的基因表达。 结果成功制备特异性好、效价较高的多克隆抗体。激光共聚焦显微镜显示MRP定位于HEK293细胞的细胞浆及细胞核中。MRP表达广泛,其中在脂肪、肌肉、大脑中蛋白表达量较高,其他组织也有表达。免疫荧光组化和激光共聚焦显微镜显示MRP在胰岛β细胞中有表达,在α细胞中定位于细胞浆及细胞核中。成功制备MRP Northern Blot探针。葡萄糖影响人脂肪细胞MRP基因表达,葡萄糖作用时间增加,MRP表达呈现先增加后下降的趋势。 结论我们克隆到了一个新的基因,广泛表达于人体的各个组织中。葡萄糖可以调控它在脂肪细胞中的表达。 目的:以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察不同浓度黄芪多糖对其增殖和凋亡的影响,以及对胆固醇流出和ABCA1基因表达的影响。 方法:将THP-1细胞诱导分化成泡沫细胞,用不同浓度黄芪多糖对其干预24小时,XTT法检测细胞增殖,Annexin V/PI染色、caspase3活性检测观察细胞凋亡情况。Y计数仪检测胆固醇流出,RT-PCR及流式细胞仪检测ABCA1的表达。 结果:黄芪多糖呈剂量依赖性(10-100μg/ml)诱导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡,抑制增殖;促进胆固醇流出,增加ABCA1的表达。 结论:黄芪多糖可影响THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡及增殖,通过增加ABCA1的表达而促进胆固醇流出。


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