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大鼠前扣带皮层吻侧部NMDA受体在痛厌恶情绪形成中的作用

任文华  
【摘要】: 疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验,它包含感觉和情绪两个基本成分。动物及人类的脑成像、电生理学和行为学等证据表明伤害性刺激或预警信号均可激活前扣带皮层(ACC)。损伤ACC特别是它的吻侧部,可以破坏痛相关厌恶情绪的形成。大量研究表明,兴奋性氨基酸尤其是谷氨酸在ACC兴奋性突触传递中具有关键作用。本实验室过去的工作表明ACC内注射NMDA受体谷氨酸位点拮抗剂APV可以阻断福尔马林条件位置回避(F-CPA)的形成(一种反映痛相关厌恶情绪的行为模型),提示ACC内NMDA受体的激活在痛相关的情绪形成过程中发挥重要的作用。 功能性NMDA受体是由一个必需的NR1亚基和一个或多个NR2A-D亚基构成的异聚体,它的功能受多种因素调节,在这个异聚体离子通道上有多个激动剂结合位点及调制位点,其中之一就是位于NR1亚基的甘氨酸(Gly)位点。NMDA受体离子通道的开放需要谷氨酸(Glu)和Gly位点同时被占据,因此,甘氨酸位点被称为协同激动剂(co-agonist)位点。鉴于NMDA受体的选择性或者非选择性拮抗剂都有非常严重副作用如精神错乱、共济失调等,NMDA受体的构成或调节亚基逐渐成为药理学倍加关注的靶向位点。其中,寻找NMDA受体Gly位点和亚基的特异性拮抗剂可能是最有前景的战略之一。我们实验室前期的工作显示:在ACC薄片上,D型丝氨酸(D-ser),甘氨酸位点的内源性激动剂,可增强NMDA诱导的电流;灌流D-ser代谢酶DAAO,可抑制NMDA诱导的电流,提示ACC内NMDA受体Gly位点尚未饱和,内源性D-ser参与NMDA受体的调节。 基于上述结果,本研究首先系统考察了大鼠前扣带皮层,特别是其吻侧部(rACC)NMDA受体Gly位点及其内源性激动剂D-Ser在痛相关厌恶情绪形成中的作用。考虑到NR2亚基在前脑的分和主要以NR2A和NR2B两个亚基为主,我们又分别对NR2A和NR2B亚基在痛厌恶情绪形成中的作用进行了初步的探索。并在此基础上,探讨了NMDA受体介导痛相关厌恶情绪形成的可能机制。 实验采用的动物模型是福尔马林条件位置回避模型,即:将大鼠单侧足底皮下注射福尔马林所引起的疼痛与某种特定的场景相匹配进行条件位置回避训练,可以引起大鼠对这一场景的回避行为。结合这一整体行为训练、免疫组织化学和western blot等方法,本研究获得如下主要结果: 1.通过对原有的条件位置回避训练方法的改进,本研究所采用的训练模式能够更加稳定地建立大鼠福尔马林条件位置回避(F-CPA)。当单侧足底注射福尔马林(5%,50μl)同条件训练装置中某个特定的训练室相匹配时,95%以上的大鼠经训练后在条件室滞留的时间与训练前相比明显缩短。表明经条件训练的大鼠能够很好地对伤害性刺激场景进行回避。 2.为测试NMDA受体Gly位点抑制剂对痛厌恶情绪的影响,F-CPA条件训练前20分钟,大鼠rACC内微量注射NMDA受体Gly位点拮抗剂7-氯犬尿酸(7-Cl-KYNA)(0.02,0.2,2mM,每侧0.6μl)。在0.2mM和2mM浓度时,7-Cl-KYNA完全阻断F-CPA的形成。作为对照,我们也观察了7-Cl-KYNA对另一种条件位置回避,即足底弱电击刺激引起的恐惧条件回避(S-CPA)的影响。以0.5mA,2s的电击和特定的条件室匹配时,大鼠能够形成条件位置回避。S-CPA条件训练前,于双侧rACC内微量注射2mM的7-Cl-KYNA对大鼠S-CPA的形成无影响。 3.为测试NMDA受体Gly位点内源性激动剂D-Ser在痛厌恶情绪形成中的作用,F-CPA条件训练前20分钟在双侧rACC内给予D-ser的代谢酶DAAO(0.01,0.1单位,每侧0.6μl)。接受0.1单位DAAO注射大鼠不能形成条件位置回避。作为对照,我们进一步观察了阻断rACC内Gly位点或耗竭其内源性激动剂对单侧足底注射福尔马林诱导的急性痛反应的影响。双侧rACC注射DAAO(0.1单位)或7-Cl-KYNA(2mM)均不改变福尔马林引起的双时相伤害性行为反应。 4.为测试rACC内NMDA受体亚单位在痛厌恶情绪形成中的可能作用,我们首先对NMDA受体亚单位NR1,NR2A和NR2B在rACC内的表达及其对福尔马林伤害性刺激的反应进行了检测。NR1在双侧rACC内有较高的基础表达,NR2A和NR2B在双侧rACC也有中等程度的基础表达;与NRl亚基的分布相似,NR2A和NR2B免疫阳性细胞也主要分布在rACC的第Ⅱ到Ⅵ层,并呈现由浅入深梯度减少的趋势;在rACC内表达NR1,NR2A和NR2B免疫阳性的细胞主要是神经元。单侧足底注射福尔马林(5%,50μl)后40分钟或6小时,致炎侧和非致炎侧rACC内的NMDA受体NRl亚基表达水平与致炎前相比没有显著变化,但NMDA受体NR2A和NR2B亚基在双侧rACC内的表达量均明显上调。于F-CPA条件训练前20分钟,双侧rACC内给予NR2A亚基特异性拮抗剂NVP-AAM077或NR2B亚基特异性拮抗剂ifenprodil完全阻断大鼠F-CPA的形成。 5.为进一步探讨NMDA受体及其亚单位介导痛厌恶情绪形成的可能机制,我们在离体rACC脑片观察了激活NMDA受体对胞内信号分子ERK和CREB磷酸化水平的影响。将rACC脑片在含NMDA(20mM)的ACSF中孵育10分钟后,rACC内pERK和pCREB的表达量明显上调。ERK和CREB的这种激活,可被预先孵育10分钟下列任何一种NMDA受体功能抑制剂:7-Cl-KYNA(50μM),APV(50μM),DAAO(0.2U/ml)和Ifenprodil(3μM)所抑制;预先孵育ERK抑制剂PD-98059(50μM)40分钟,NMDA诱导的ERK和CREB在rACC内的激活也受到明显抑制。 以上结果表明,激活rACC内NMDA受体的Gly位点和NMDA受体NR2A和NR2B亚基的功能性激活对痛相关厌恶情绪的形成是必需的;激活rACC内NMDA受体导致ERK-CREB信号通路的激活,可能是NMDA受体介导痛厌恶情绪形成的细胞和分子机制。综上所述,选择性抑制NMDA受体的Gly位点,或阻断NR2A和NR2B亚基,可能成为阻止慢性痛患者遭受恶性情绪困扰的一个更有前景的治疗方向。


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