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冠状动脉介入诊疗术后急性肾损伤的发病及造影剂肾病相关尿液标志蛋白的筛选和诊断预测模型的建立

方艺  
【摘要】: 造影剂肾病(contrast-induced nephropathy,CIN)是注射造影剂后新发生的肾损伤,血肌酐水平较基础值上升25%,并排除其他影响因素。随着现代影像技术和介入治疗的不断发展,需要应用造影剂的机会不断增多,由此可能产生CIN的危险性也大大增多,CIN已成为医院获得性急性肾衰竭的第三位常见原因。对CIN的早期识别是早期干预、阻止病情加重、降低危重急性肾衰竭发病率、从而最终提高治疗效果的前提和关键,但临床上缺乏早期诊断CIN的生物指标。新兴的蛋白组学,是对基因组所编码的所有蛋白质进行研究的学科。通过尿液蛋白质组学使我们对造影剂肾病的发病有了更详尽的理解,并通过特异的尿液标志物来早期诊断和预测患者预后。 表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption/ionization,time of flight,mass spectroscopy SELDI-TOF-MS)是蛋白质组学新兴运用的技术,已有众多的研究利用该技术在患者体液中发现了能够早期诊断疾病的标志物。本课题研究目的就是希望在造影剂肾病患者造影术后早期的尿液标本中找到能够预示疾病发生的生物标记物,并建立尿液蛋白质组的诊断和预测模型。 第一部分蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台的建立 本部分研究目的是建立稳定的蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台,优化实验的技术条件。选择数名接受冠脉造影或冠脉介入手术患者术后第一天晨尿,分别采用WCX2、H4、SAX2、IMAC3四种化学蛋白质芯片,经SELDI-TOF-MS检测蛋白质谱,根据蛋白质指纹峰的分布、表达和数量确定标本合适的化学蛋白质芯片,优化检测参数,对该技术的稳定性和可靠性进行评估。 结果 1.四种尿液蛋白指纹图均显示蛋白指纹峰主要分布在1100~30000(M/Z质荷比)范围内。 2.四种尿液蛋白质指纹图比较,蛋白峰最多的为IMAC3芯片,WCX2其次,而H4和SAX2较少。 3.同一标本同一芯片内检测蛋白质峰强度的变异系数(CV)值为0.1928,m/z的CV值为0.000453 4.同一标本不同芯片间蛋白质峰的CV值为0.214244,m/z的CV值为0.000055。 第二部分低渗非离子造影剂对冠状动脉介入诊疗术患者肾功能影响的前瞻性研究 本部分研究目的是了解低渗非离子造影剂对冠状动脉介入诊疗术患者肾功能的影响,以及造影剂肾病(Contrast induced nephropathy,CIN)的发病率及危险因素。2005年11月~2006年5月期间共有275例接受冠状动脉介入诊疗手术(PCI和/或冠状动脉造影)的住院患者入选,所有患者均无肾脏基础疾病,且均应用低渗非离子造影剂。以术后24~48h内血肌酐水平较基础值上升25%为CIN诊断标准,计算CIN发病率。测定造影前肾功能、尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(n-acetyl-β-d-glucosaminidase,NAG)、尿渗透压和术后肾功能、尿NAG、尿渗透压,分析造影剂对冠状动脉介入诊疗术患者肾功能的影响。 结果: 1.275例患者中,男性203例,女性72例,平均年龄63.5±11.6岁,发生CIN 11例,发病率4.00%。糖尿病与非糖尿病患者CIN的发病率无明显差别(P>0.05)。 2.在264例未发生CIN病人中,造影后第1d,尿NAG显著高于造影前尿NAG水平(P<0.05);造影后第2d,尿NAG已与造影前无明显差别(P>0.05)。11例CIN病人中,造影后第1、2d,尿NAG、SCr均显著高于造影前尿NAG水平(P<0.05),但造影后第6天基本回复至基础水平。 3.平均造影剂剂量CIN组为318.4±153.8ml,非CIN组为227.9±121.9ml,两组比较亦有显著差异(P<0.01)。 第三部分与冠脉介入诊疗术后造影剂肾病发生相关的尿液标志蛋白筛选及诊断预测模型建立 本部分研究目的是筛选冠脉介入术后发生造影剂肾病患者与未发生造影剂肾病患者尿液中的差异蛋白,为进一步寻找预测造影剂肾病的尿液标记物提供研究基础,并建立诊断预测模型。选择11例冠脉造影术后发生造影剂肾病和22例未发生造影剂肾病患者,分别收集患者术前和术后第一、第二天晨尿标本,利用IMAC3蛋白质芯片,建立尿液全蛋白质指纹图谱,经Biomarker Wizard软件对尿液蛋白指纹图谱比较分析,获得造影前后尿液差异蛋白指纹峰以及造影剂肾病患者和未发生造影剂肾病患者术后尿液差异蛋白指纹峰。对获得的差异蛋白利用Biomarker Patterns Software(BPS)建立与造影剂肾病发病相关的尿液生物标记物诊断预测模型。 结果: 1.经检验11例CIN患者与22例未发生CIN患者在年龄、性别、术前心功能分级无明显差异;而造影剂使用剂量存在差异。 2.在M/Z 2000~30000范围内,术前尿液标本和术后第一天晨尿标本比较,共检测出36个蛋白峰。IMAC3芯片建立的蛋白指纹图谱中,术前和术后第一天晨尿相比较,17个差异蛋白有统计学意义(P<0.05),其中上调蛋白15个,M/Z为11943、111762、11707、5889、5320、5995、13393、13322、23537、14730、13923、14640、7060、3916、2801;下调2个,M/Z为8896、9519。 3.比较发生CIN和未发生CIN组术后第一天晨尿样本,共检出55个蛋白峰,其中13个差异蛋白有统计学意义(p<0.05)。CIN组与未发生CIN组比较,上调蛋白5个,M/Z为1797、2092、4357、3913、8195;下调蛋白8个,M/Z为2794、5505、26043、2195、16919、25759、2440、20514。。 4.非CIN组术后第二天晨尿标本(术后24~48小时)与术后第一天晨尿标本(术后12~24小时)相比,M/Z为11734、5930、蛋白峰下降,且有统计学意义(p<0.05)。而CIN组患者的无上述改变。 5.11例冠脉介入术后发生CIN患者和22例未发生CIN患者的尿蛋白谱建立CIN的决策树判断模型,由M/Z为2793,2091的两个蛋白峰组成,该模型的灵敏性为72.7%(8/11),特异性为81.82%(18/22)。 第四部分住院患者急性肾损伤的发病情况调查 本部分的研究目的是了解我国综合性医院住院患者急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)的发病率、病因构成、患者的预后以及肾功能受损对住院费用和住院时间的影响。通过查询复旦大学附属中山医院2004年9月1日~2005年8月31日住院患者肾功能检测结果,筛检出AKI患者,进行病史复习,了解患者的临床特征及其转归、肾功能受损的性质、导致肾功能不全的基础疾病等。 结果: 1.观察期间共有住院患者37365例次,其中1228例患者住院期间发生AKI,发病率为3.27%。 2.观察期间住院患者总死亡率为1.52%,其中AKI患者死亡率为18.57%,经校正后AKI对患者住院死亡率的OR值为10.09(p<0.01)。 3.Logistic回归分析提示高龄、住院费用的增加、血肌酐值(Serum creatinine,Scr)上升的百分比及其上升的绝对值是AKI患者死亡的危险因素。 结论 1.住院患者AKI的发病较常见,患者Scr水平轻度的上升(≥25%)即可增加死亡的风险,增加住院费用,延长住院天数。患者的预后同肾脏损伤的程度相关,其死亡率随Scr上升百分数的增加而增加。 2.冠脉介入术后CIN的发病率不低,低渗非离子造影剂仍可诱发急性肾损伤。尿NAG水平升高可反映肾小管功能损害,大部分病人造影后6d肾功能可恢复至基础水平,少部分可残留肾功能损害;③造影剂剂量是导致非肾脏疾病患者冠脉介入术后发生CIN的独立危险因素之一。 3.蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术重复性高、稳定性好,是比较理想的蛋白质组学研究技术平台;IMAC3是尿液蛋白质组研究重要工具,样品的质量控制和操作过程的标准化将直接影响实验结果的可靠性。 4.由蛋白芯片与SELDI-TOF组合,高通量筛选出的造影剂肾病患者尿液小分子量差异相关候选蛋白,对造影剂肾损害发病机制的阐明及预测诊断标志物的发现具有重要的临床意义;而由BPS形成的决策树诊断模型在判断CIN肾病和预测患者预后与传统指标比显示独特的优势 创新点: 1.建立了造影剂肾病患者造影术后尿液蛋白质指纹图谱。 2.应用蛋白质芯片进行CIN研究为首次 3.首次从尿液蛋白质组学的角度建立造影剂肾病的诊断和预测模型。 4.实验筛选出的差异蛋白为早期诊断造影剂肾病,预测预后提供灵敏和特异的指标,为今后CIN发病机制建立了研究基础。


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