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骨桥蛋白对胃癌细胞生长、侵袭以及对化疗药物敏感性的影响

刘天舒  
【摘要】: 胃癌是常见的恶性肿瘤。在我国,胃癌的发病率在男性中为第二位,在女性为第三位。其中三分之一的胃癌在发现时已属晚期,失去手术根治的机会。即使是手术根治的胃癌,60%—70%发生局部复发或远处转移。因此化疗已成为临床上常用的治疗方法。但是胃癌在不同的化疗方案中的有效率只有40%—50%。因此临床上急需探索可能提高胃癌治疗药物疗效的方法。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)在文献中被认为与多种肿瘤的发生发展相关,可能成为肿瘤治疗的靶点。本研究首先检测了在不同分化程度的胃癌细胞株中骨桥蛋白的表达,然后通过RNA干扰技术下调胃癌细胞中骨桥蛋白的表达,体外实验观察骨桥蛋白对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响,并观察骨桥蛋白下调后胃癌细胞对化疗药物的敏感性的改变,为胃癌治疗寻找新的方向提供基础和理论依据。 一、骨桥蛋白在不同分化程度的胃癌细胞株中的表达 目的:了解OPN在不同分化程度的人胃癌细胞株中的表达。方法:通过Real-time PCR和Western-blot方法从mRNA和蛋白水平检测了三株不同分化程度的胃癌细胞株(MKN28、SGC7901和BGC823)中骨桥蛋白(OPN)的表达。结果:三株细胞的形态学显示MKN28为高分化的胃癌细胞株,SGC7901为中分化的细胞株;BGC823为未分化的细胞株;Real-time PCR的结果提示MKN28和SGC7901两株细胞株表达OPNmRNA,但是BGC823未能检测出有OPN的表达;Western-blot检测OPN蛋白在三种胃癌细胞株中的表达差异结果显示OPN蛋白在MKN28和SGC7901中有表达,但是在BGC823中未见表达。结论:骨桥蛋白(OPN)在胃癌细胞株MKN28和SGC7901中均有表达,但是在BGC823中无表达。 二、RNA干扰下调OPN表达对胃癌细胞生长和运动能力的影响 目的:探讨OPN下调后对胃癌细胞株MKN28和SGC7901的生物学行为的影响。方法:参考相关文献并设计OPN的小片断的干扰RNA,技术合成,并通过荧光标记测定两株细胞的转染效率;Western印迹法检测OPN蛋白下调的情况;实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)检测siRNA对OPNmRNA的下调率以及随时间的变化;流式细胞仪检测转染前后细胞周期和凋亡变化;MTT法连续七天检测肿瘤细胞在OPN有无干扰时的增殖变化,并采用混合模型进行统计分析;Transwell实验检测细胞转染前后的运动侵袭能力并用t检验进行分析。结果:通过荧光显微镜下标记FITC的OPNsiRNA的转染效率在两株细胞中均在90%以上;Western印迹发现,无论是内参选用GAPDH或β-actin,OPN蛋白在干扰后的两株细胞中的表达均有下调;Real-time PCR结果提示SGC7901细胞在siRNA转染后72小时OPNmRNA表达下降最低,达47%,MKN28细胞在siRNA转染后48小时OPNmRNA表达下降最低,达40%;连续7天对干扰组和未干扰组细胞进行MTT分析,结果提示OPN被干扰后,SGC7901细胞和MKN28细胞的增殖能力明显减弱(混合模型分析与未干扰组相比,P<0.01),其中SGC7901细胞在siRNA转染后的第5至第7天,干扰组的细胞增殖能力显著低于未干扰组,而MKN28细胞在siRNA转染后的第1至第5天表现为干扰组的细胞增殖能力显著低于未干扰组;流式细胞仪的检测结果显示OPN被干扰后MKN28和SGC7901的细胞周期受到影响,其中SGC7901细胞的分裂期细胞比例由原来的18.78%下降到17.02%,MKN28细胞的分裂期细胞比例由原来的4.96%下降到0.39%;两株细胞都没有发现下调OPN后诱发细胞凋亡。Transwell实验检测细胞的运动侵袭能力显示,OPN下调后,两株肿瘤细胞的运动侵袭能力都下降,穿过人工基底膜的细胞数明显减少(SGC7901:t=5.172,P<0.01;MKN28:t=11.365,P<0.01)。结论:本研究中合成的小片断RNA能够下调MKN28和SGC7901中OPN的表达,OPN可能与MKN28和SGC7901细胞的增殖和运动侵袭相关。 三、OPN下调后的胃癌细胞株对细胞毒药物的敏感性检测 目的:探索OPN能否成为胃癌的药物治疗的靶点。方法:选用胃癌细胞株SGC7901和MKN28,使用第二部分的OPN小分子干扰的方法,分设OPN干扰组和未干扰组,加入5FU、DDP、ADM、MMC四种药物,并分别设四个浓度梯度,采用偶氮四唑蓝(MTT)方法,分别在未加药时、加药后的48小时、72小时、96小时测定吸光值,绘制各组细胞的时间和吸光值曲线,所有数据进行混合模型统计分析。结果:SGC7901细胞在OPN被干扰后,发现细胞在接受5FU、ADM和MMC处理时,增殖能力较未干扰组有明显的减低(P<0.05),表明OPN干扰能增加这些药物抑制胃癌细胞MKN28生长的能力,但是在接受DDP处理时,干扰组和未干扰组没有见到明显的差别。MKN28细胞在接受5FU、DDP和ADM处理时,干扰组细胞较未干扰组细胞的增殖有明显的降低(P<0.05),表明OPN干扰能增加这些药物抑制胃癌细胞MKN28生长的能力,但是在接受MMC处理时,干扰组和未干扰组没有见到明显的差别。结论:OPN干扰对MKN28细胞和SGC7901细胞提高对细胞毒药物的敏感性有一定的帮助,可能成为胃癌的药物治疗中的联合靶点,但是不是对所有的细胞毒药物都具有增敏作用,其机制还需进一步研究。 四、小结 本研究在三株人胃癌细胞株中运用不同方法比较了骨桥蛋白的表达情况,结果提示骨桥蛋白在多数的胃癌细胞株中的表达水平是增高的;通过RNA干扰技术下调OPN在胃癌细胞中的表达,通过比较干扰前后的生物学行为改变,证明了OPN参与胃癌细胞的生长和侵袭转移;并通过RNA干扰技术下调OPN的表达后,观察到在SGC7901细胞和MKN28细胞中,OPN下调可提高一些化疗药物的敏感性,提示OPN干扰可能成为胃癌的药物治疗中的联合靶点。


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