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限食生物学效应与胰岛素信号通路基因表达关系的研究

吴昊  
【摘要】: 背景:随着生活水平的不断提高,营养与健康的关系日益受到人们的关注,虽然怎样的膳食结构最有利于健康还存在争论,但大量动物实验研究结果提示,适当限食具有确凿的健康促进作用。限食具有独特的生物学效应:①限制饮食可以延长最大寿命和平均寿命;②限食减轻或延缓老年病的发生;③限食延寿的核心作用是降低老化的速度,并非是单纯的防病;④限食延寿是在多种物种中观察到的普遍现象。限食延寿是公认的最有效的抗衰老范例。因此限食也是研究老化过程的最佳模式,优于与之比较的任何候选的抗衰老方案。因此,有关限食机制的研究多年来一直是生物医学的一个研究热点。那么限食延寿在一片赞扬声中为什么还停留在实验室研究阶段,而没有被广泛地推广应用呢,主要因为一方面人群研究困难,另一方面是限食效应的机制至今仍不清楚。揭示限食延寿的机制,从本质上阐明其作用原理,是确保此项方法的合理应用和健康发展的关键。多年的研究过程中,科学家们提出了多种限食效应的假说,但都不能概括限食延缓衰老的作用机制。随着基因组时代到来,限食研究也进入分子生物学时代。科学家们几近达成这样的一个共识,即生物体的寿命是由基因决定的,因为通过对某些基因的修饰,一些生物体的寿命成倍增长。比较这些已取得的延缓衰老的大量研究成果我们发现,胰岛素或胰岛素样生长因子(Insulin/IGF)信号通路基因是生物体内主要的抗衰老途径,而限食的生物标志就是血清胰岛素水平显著降低,胰岛素敏感性显著增加。为此我们推测胰岛素信号通路相关基因可能是限食效应的重要基础。 目的:分别研究限食对小鼠胰岛素信号通路相关基因、糖代谢等相关基因表达的影响,分析差异表达基因的功能和相互联系,探讨限食生物学效应的可能分子机制。 方法:①复制小鼠限食模型:24只2月龄C57BL/6N小鼠单笼饲养,适应一周后,随机分为2组,对照组(Ad libitum,AL组,自由摄食组,12只)和限食组(Dietary restriction,DR组,12只,进食对照组60%饲料);限食3个半月后,禁食18小时,摘眼球取血,采用美国强生公司出品的One-TouchⅡ型血糖仪和血糖仪试纸测定血糖水平,采用美国LINCO Research RI-13K放免试剂盒测定血清胰岛素浓度。记录体重、主要脏器重。②采用美国SuperArray公司设计的Q Series Insulin Signaling Pathway Gene Array基因芯片检测小鼠附睾脂肪垫96个胰岛素信号通路基因表达,采用SYBR Green 1荧光嵌合法在部分差异表达的基因中选出2个基因Akt3和Npy对杂交结果进行进一步验证。③采用美国SuperArray公司设计的小鼠糖尿病基因芯片(Oligo GEArray Mouse Diabetes Microarray,OMM-023)检测了肝脏中包含与糖代谢、糖尿病、胰岛素抵抗等相关的114个基因,采用SYBR Green 1荧光嵌合法,检测Akt2基因的表达以对杂交结果进行进一步验证。④采用Western blotting法检测了限食对小鼠肝AKT2和附睾脂肪垫AKT3蛋白表达。⑤采用双夹心抗体法(AKT磷酸化信号通路试剂盒)检测小鼠肝和附睾脂肪垫AKT(Ser~(473)和Thr~(308))磷酸化水平。 结果:①限食30天后,限食组与自由摄食组小鼠体重相差开始显著(15.85±1.32vs 19.05±2.06,n=12,p<0.05);限食100天后限食组与自由摄食组小鼠体重分别为(18.97±1.21 vs 26.01±1.87,n=12,p<0.05);限食后主要脏器重量(肝、心、肾、胰和附睾脂肪垫)均显著下降,分别是自由摄食组的68.2%,43.6%,71.1%,42.4%,39.8%,其中附睾脂肪垫重量降幅最大;限食可显著降低血清胰岛素水平。②在被检测的96个胰岛素信号通路基因中,上调2倍以上的基因有20个,下调2倍以上的基因有11个;DR组与AL组Npy和Akt3基因的Real Time PCR验证表达比分别是0.239和3.67,与芯片的结果0.2和4.09基本相符。③在被检测的肝组织糖代谢相关114个基因中,上调2倍以上的基因有20个,下调2倍以上的基因有2个;DR组与AL组AKT2基因的Real Time PCR验证表达比是2.04,与芯片的结果2.84基本相符。④限食可显著增加小鼠肝AKT2蛋白的表达量(1.748±0.143 vs1.025±0.093,n=4,P<0.05);限食可显著增加小鼠附睾脂肪垫AKT3蛋白的表达量(1.03±0.095 vs 0.72±0.07,n=4,P<0.05)⑤限食对小鼠肝(1.13±0.07 vs 1.06±0.09,n=6)和脂肪垫(1.05±0.1 vs 0.95±0.08,n=6)AKT(Thr~(308))磷酸化水平影响不显著。限食可显著增加小鼠肝(1.17±0.069 vs 1.54±0.12,n=6,P<0.05)和脂肪垫(1.12±0.14 vs 1.51±0.1,n=6,P<0.05)AKTSer~(473)磷酸化水平。 结论:①限食模型复制是成功的;②限食可影响小鼠附睾脂肪垫胰岛素信号通路32.3%(31/96)基因的表达,远远超过目前国外相关报道较多的少数几个胰岛素信号通路基因。其中PI3K-AKT3-GSK-3β通路值得进一步关注,胰岛素信号通路基因的表达与限食效应可能存在密切联系;③限食引起的以附睾脂肪垫为代表的体脂大大降低可能是限食小鼠胰岛素敏感性增高的原因。④限食可影响小鼠肝糖代谢、胰岛素抗性和脂代谢等19.2%(22/114)相关基因的表达。其中限食对AKT2、胰岛素降解酶(IDE)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、CAAT增强子结合蛋白δ(C/EBPδ)、肾素-血管紧张素系统(RAS)三种主要成分(AGT/ACE/ACE2)等基因表达的影响有待于进一步研究。⑤由于限食可同时在转录水平和翻译水平影响肝AKT2蛋白和附睾脂肪垫AKT3蛋白表达与合成,且限食可显著增加小鼠肝和脂肪垫AKTSer~(173)磷酸化水平,AKT家族成员可能在限食生物学效应中发挥重要作用。


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