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银杏叶提取物(GBE50)预防血管内皮功能障碍的体外实验研究

沈建颖  
【摘要】: 第一部分银杏叶提取物GBE50(及其主成分总黄酮)对缺氧致人脐静脉内皮细胞凋亡及ROS生成的作用 目的观察银杏叶提取物GBESO及其主成分总黄酮对缺氧致人脐静脉内皮细胞ROS生成及凋亡的保护作用。 方法通过消化法获得人脐静脉内皮细胞(HUVECs),传代后干预分组如下:N组(正常对照),H组(缺氧24h),HG组(缺氧前GBE50干预4h)和HF组(缺氧前总黄酮干预4h),其中GBE50和总黄酮各有3个浓度:12.5、25及50μg/ml。采用流式细胞仪测各组ROS(活性氧)水平及早期凋亡率(AnnexinV),通过TUNEL测晚期凋亡率,探讨缺氧及GBE50和总黄酮对内皮细胞凋亡及其ROS生成的影响。 结果1.H组ROS水平较N组明显增加,由(9.88±0.97)%升至(29.27±2.21)%,有显著性差异(P<0.05);HG各浓度组与H组相比ROS水平均下降,但与N组及H组相比均无明显差异(P>0.05):HF各浓度组与H组相比ROS水平均明显下降(P<0.05),其中总黄酮浓度为50μg/ml时ROS水平降至最低,为(7.42±1.81)%。2.H组细胞AnnexinV阳性率较N组明显增加,由(9.00±1.00)%升至(18.47±2.53)%,有显著性差异(P<0.05);HG25μg/ml时为(10.69±2.08)%,显著降低了内皮细胞的AnnexinV阳性率(P<0.05);HF各浓度组均能不同程度地降低AnnexinV阳性率,但尚无统计学差异(P>0.05),该保护效应在总黄酮浓度为50μg/ml时最明显,AnnexinV阳性率为(14.25±2.22)%。3.H组TUNEL阳性率较N组明显增加,由(1.28±0.65)%升至(8.59±1.10)%,有显著性差异(P<0.05);HG 25μg/ml时降至(3.58±0.28)%,HF50μg/ml为(3.06±0.40)%,较H组均明显下降(P<0.05)。 结论缺氧可导致HUVEC ROS生成增加伴凋亡增多。而GBE 50及总黄酮可降低缺氧所致的ROS生成增多及凋亡增加,GBE50及总黄酮对缺氧所致的内皮功能障碍有一定的保护作用。 第二部分银杏叶提取物GBE50对抗缺氧致内皮功能障碍的影响及部分机制探讨 目的初步探讨银杏叶提取物GBE50对抗缺氧致人脐静脉内皮细胞功能障碍的分子机制。 方法通过消化法获得HUVEC,传代后干预分组如下:N组(正常对照),NG组(GBE50 25μg/ml干预4h后不予缺氧处理),H组(缺氧24h)及HG组(GBE50 25μg/ml干预4h后缺氧24h)。应用RT-PCR半定量检测各组vWF(von willebrand因子)、ET-1(内皮素-1)及PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的mRNA表达水平,运用Western-blot测各组eNOS(内皮型一氧化氮合酶)及PPARγ的蛋白表达水平。 结果1.vWF的mRNA表达水平:N组为(0.55±0.05)%,H组为(0.84±0.14)%,H组vWF表达较N组明显增加(P<0.05);HG组为(0.58±0.24)%,与H组相比明显降低(P<0.05)。2.ET-1的mRNA表达水平:N组为(0.14±0.03)%,H组为(0.31±0.03)%,H组ET-1表达较N组明显增加(P<0.05);HG为(0.26±0.02)%,与H组相比明显降低(P<0.05)。3.eNOS蛋白表达水平:H组eNOS蛋白表达较N组明显增加,由(0.30±0.04)%升至(0.59±0.08)%,有显著性差异(P<0.05);HG组降至(0.43±0.08)%,但与其它各组相比无统计学差异(P>0.05)。4.PPARγ的mRNA表达水平:N组为(0.40±0.02)%,H组为(0.42±0.01)%,HG组为(0.42±0.01)%,各组之间无差异(P>0.05)。5.PPARγ的蛋白表达水平:N组为(0.10±0.02)%,H组为(0.13±0.05)%,HG组为(0.13±0.04)%,各组相比无改变(P>0.05)。 结论内皮细胞缺氧损伤时可导致ET-1、vWF及eNOS的表达增加,内皮细胞在缺氧前给予GBE50 25μg/ml后,可降低缺氧导致的ET-1、vWF的表达增加,部分降低因缺氧导致的eNOS蛋白表达的增高,提示缺氧及GBESO对上述因子的表达起作用。缺氧及GBE50对PPARγ的mRNA及蛋白水平均无影响,提示缺氧及GBE50不通过PPARγ途径起作用。 第三部分银杏叶提取物GBE50在缺氧致内皮功能障碍中抗凋亡作用的初步研究 目的探讨银杏叶提取物GBE50对缺氧致人脐静脉内皮细胞凋亡信号分子mRNA表达水平的调节。 方法应用人细胞凋亡基因表达谱cDNA芯片筛选出凋亡通路上的差异表达基因谱,再运用RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。 结果1.基因芯片结果:缺氧干预内皮细胞24小时后,H组(缺氧24h)较N组(正常对照)上调了15个基因;而HG组(缺氧前4h予GBE 50 25μ/ml进行干预)较N组上调了38个基因,下调了69个基因。2.RT-PCR验证结果:内皮细胞经缺氧损伤后,ATM(毛细血管扩张性共济失调症突变基因)的mRNA表达由N组的(0.40±0.01)%升至H组的(0.47±0.09)%,H组较N组明显增加(P<0.05);HG组则降至(0.23±0.11)%,较H组明显降低(P<0.05)。TNFSF10(肿瘤坏死因子超家族成员10)mRNA的表达N组为(0.05±0.01)%,H组为(0.20±0.13)%,H组较N组明显增加(P<0.05);HG组降至(0.01±0.01)%,较H组明显降低(P<0.05)。 结论ATM及TNFSF10两者mRNA水平表达的改变和缺氧及GBE50的干预密切相关。ATM及TNFSF10在缺氧致内皮细胞凋亡及GBE50抗内皮细胞凋亡中起到重要作用。


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