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IL-4/IFNγ基因多态性与RSV毛细支气管炎易感性的研究

张明智  
【摘要】: 研究背景与目的 呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎是婴幼儿冬季的多发病,在婴儿中的发病率达70%,约1%-2%的婴幼儿会发展为重症,危重者可导致死亡。重症者即使好转后会引起长期的咳嗽、气喘、反复呼吸道感染,而轻症者预后良好。流行病学调查发现不仅有基础疾病的患儿(先天性心脏病、免疫缺陷、早产、支气管肺发育不良等)可能发展为重症RSV毛细支气管炎,而且无危险因素的婴幼儿也会发展为重症,目前世界范围内尚无安全、有效的疫苗接种。 大量研究表明机体自身的免疫决定着RSV毛细支气管炎的发展趋向,机体感染RSV后会产生一系列的Th1/Th2细胞因子,如IFNγ、IL-12、IL-10、IL-4、IL-5、等,这些因子相互作用决定着疾病的转归。目前研究认为RSV毛细支气管炎的免疫机理是Th1/Th2反应的失衡。而Th1/Th2细胞因子的体内浓度又与其基因的多态性与有很大的关系。Hull等在高加索人群中的研究提示:重症RSV毛细支气管炎与IL-8、CCR5、IL-10的单核苷酸多态性有关。但从Th1/Th2角度研究细胞因子的基因多态性与重症RSV毛细支气管炎的关系的报道还较少,况且由于人种不同,基因多态性的分布有很大的差异。 本课题通过研究RSV毛细支气管炎患儿Th1/Th2细胞因子(IFNγ/IL-4)的单核苷酸多态性及其所构建的单倍型,从而了解在中国上海汉族人群中IFNγ/IL-4单核苷酸多态性与RSV毛细支气管炎病情的关系,探讨遗传机制的差异对疾病发生和预后的影响,为今后个体化用药以及疫苗的制备提供实验资料。 实验对象与方法 1.研究对象选自2005年9月~2007年1月在复旦大学附属儿科医院住院的肺炎儿童。所有患儿年龄24个月且为汉族。除外先天性心脏病,免疫缺陷,先天性支气管肺发育不良、早产(胎龄36周),生后进行机械通气者以及使用皮质激素、免疫抑制剂者。分组:RSV毛细支气管炎组168例,男96例,女72例,为RSV阳性;非RSV感染肺炎组215例,男114例,女101例;另选非呼吸道感染的外科住院儿童和儿童保健门诊儿童88例,男47例,女41例作为正常对照组。 2.方法:提取外周血基因组DNA,MGB-TaqMan探针法或毛细管电泳法检测各组对象IL-4的-589位点、-33位点和IFNγ基因第一内含子区CA重复序列的基因型,同时用ELISA方法测定50例RSV毛细支气管炎、50例非RSV肺炎患儿血清IL-4、IFNγ的浓度,并采用呼吸评分法对RSV毛细支气管炎患儿进行RSV毛细支气管炎临床严重度的评估。最后运用PHASE软件、LDA1.0软件对IL-4基因多态性进行单倍型构建与连锁不平衡分析;SPSS 11.5软件进行卡方检验,检测各位点基因型、等位基因、IL-4单倍型、IL-4与IFNγ位点的组合基因型在各组分布的频率差异;非参数检验和方差分析来检测各组间IL-4、IFNγ水平的差异和RSV毛细支气管炎组中各基因型呼吸评分的差异。 结果 1.IL-4及IFNγ基因多态性位点的基因型在三组对象中的分布符合Hardy-Weinberg平衡;RSV毛细支气管炎组、非RSV肺炎组和正常对照组性别、年龄分布无显著差别(p0.05)。 2.RSV毛细支气管炎组中血清IL-4浓度(pg/ml)(M=0.84,P5=0.12,P95=12.5)显著高于非RSV肺炎组(M=0.29,P5=0.10,P95=6.29),经检验差异有统计学意义(z=2.465,p=0.014)。 3.RSV毛细支气管炎组中血清IFNγ浓度(pg/ml)(M=6.22,P5=0.66,P95=61.40)低于非RSV肺炎组(M=10.07,P5=1.46,P95=96.66),差异有统计学意义(z=2.096,p=0.036)。 4.IL-4基因-589位点TT基因型患儿血清IL-4浓度(pg/ml)(M=0.87,P5=0.13,P95=6.94)高于CT基因型(M=0.77,P5=0.11,P95=11.95),经检验差异有统计学意义(z=2.357,p=0.018)。IL-4基因-33位点TT基因型患儿血清IL-4浓度(M=0.84,P5=0.14,P95=7.21)与CT基因型(M=1.57,P5=0.08,P95=12.5)比较无显著性差别(z=0.088,p=0.93)。 5.IFNγCA重复12次的患儿[(CA12)~+/(CA12)~+、(CA12)~+/(CA12)~-],其血清IFNγ浓度均高于CA重复非12次的患儿[(CA12)~-/(CA12)~+],差异有统计学意义(p均0.05)。 6.RSV毛细支气管炎组IL-4基因-589位点CC、CT、TT基因型分布频率分别为1.2%、21.4%、77.4%,非RSV肺炎组为1.9%、33%、65.1%,正常对照组为1.1%、36.4%、62.5%。RSV毛细支气管炎组与非RSV肺炎组基因型分布频率比较,差异显著(χ2=6.821,p=0.033);RSV毛细支气管炎组与正常对照组比较,差异显著(χ2=6.621,p=0.037);非RSV肺炎组与与正常对照组比较,差异无显著差别(χ2=0.47,p=0.791)。三组IL-4基因-589位点等位基因频率分别为C 11.9%、18.4%、19.3%;T 88.1%、81.6%、80.7%,RSV毛细支气管炎组与非RSV肺炎组等位基因频率比较差异显著(χ2=6.012,p=0.014,OR_C=0.6,95%CI:0.398~0.905,OR_T=1.666,95%CI:1.105~2.511)。RSV毛细支气管炎组与正常对照组比较,差异显著(χ2=5.134,p=0.023);非RSV肺炎组与正常对照组比较,无显著差别(χ2=0.074,p=0.786)。 7.RSV毛细支气管炎组IL-4基因-33位点CC、CT、TT基因型分布频率分别为1.2%、23.2%、75.6%,非RSV肺炎组为2.3%、34%、63.7%,正常对照组为2.3%、39.8%、58%。RSV毛细支气管炎组与非RSV肺炎组基因型分布频率比较,差异显著(χ2=6.313,p=0.043);RSV毛细支气管炎组与正常对照组比较有显著差异(χ2=8.495,p=0.014);非RSV肺炎组与正常对照组比较无显著差异(χ2=0.929,p=0.629)。IL—4基因—33位点C/T等位基因频率分布:RSV毛细支气管炎组中C为12.8%,T为87.2%,非RSV肺炎组C为19.3%,T为80.7%,二组比较,差异有显著性(χ2=5.807,p=0.016),OR_C=0.614(95%CI:0.411~0.915);OR_T=1.63(95%CI,1.093~2.431)。正常对照组中C为22.2%,T为77.8%,与RSV毛细支气管炎组比较,差异显著(χ2=7.525,p=0.006);而非RSV肺炎组与正常对照组相比差异无显著性(χ2=0.634,p=0.426)。 8.RSV毛细支气管炎组IFNγ基因第一内含子区CA重复序列(CA12)~+/(CA12)~+、(CA12)~+/(CA12)~-、(CA12)~-/(CA12)~-基因型分布频率分别为8.93%、58.33%、32.74%,非RSV肺炎组为19.53%、52.09%、28.37%,正常对照组为19.32%、43.18%、37.50%。RSV毛细支气管炎组与非RSV肺炎组基因型分布频率比较,差异显著(χ2=8.392,p=0.015);RSV毛细支气管炎组与正常对照组比较差异显著(χ2=7.864,p=0.02);非RSV肺炎组与与正常对照组比较无显著差异(χ2=2.68,p=0.262)。RSV毛细支气管炎患儿IFNγCA重复12次的频率为38.10%,低于非RSV肺炎患儿频率45.58%,差异有显著性(χ2=4.331,p=0.037,OR_(CA12)=0.735,95%CI:0.549~0.983)。 9.RSV毛细支气管炎患儿中IL—4基因-589位点TT基因型呼吸评分为(3.02±0.44)显著高于CT基因型呼吸评分(2.81±0.46),(t=2.56,p=0.01);-33位点TT基因型患儿呼吸评分为(3.02±0.44)显著高于CT基因型呼吸评分(2.79±0.48),(t=2.835,p=0.005) 10.IFNγCA重复12次的患儿,其临床呼吸评分(2.91±0.46)显著低于CA重复序列非12次的患儿(3.0±0.43),(t=2.005,p=0.047)。 11.IL—4基因-33C/T与-589C/T之间存在连锁不平衡,D'=0.719±0.0523,r~2=0.4035,IL-4基因—33C/T与—589C/T进行单倍型构建后TT单倍型在RSV毛细支气管炎组中占80.65%,明显高于非RSV肺炎组70.47%,(p=0.001,OR_(TT)=0.572,95%CI:0.407~0.805),其它单倍型在两组中无显著性差异。IFNγ/IL-4的组合基因型Th1低活性Th2高活性基因型IFNγ(CA12)~-/(CA12)~-/IL-4—589TT/—33TT在RSV毛细支气管炎中的频率为26.79%显著高于非RSV肺炎组17.21%(p=0.023,OR=0.568,95%CI:0.347~0.929)。 结论 1.RSV毛细支气管炎患儿血清IL-4水平高于非RSV肺炎患儿,而IFNγ低于非RSV肺炎患儿,提示RSV毛细支气管炎中Th2反应占优势。IL-4基因—589位点基因多态性与IL—4表达量有关,TT基因型为高表达基因型;—33位点基因多态性与IL-4水平无关。IFNγCA重复序列多态性与IFNγ的表达量有关,CA重复12次时表达量较高。 2.IL—4基因—33位点、—589位点C/T单核苷酸多态性与RSV毛细支气管炎易感性有关,其中TT基因型、T等位基因在RSV毛细支气管炎组占明显优势,可能是RSV毛细支气管炎的易感基因。 3.IFNγCA重复序列的多态性与RSV毛细支气管炎易感性有关,CA重复非12次可能是RSV毛细支气管炎的易感基因,而CA重复12次可能对RSV毛细支气管炎有保护作用。 4.IL—4基因—33位点、—589位点TT基因型呼吸评分高于CT基因型,提示TT基因型易发展为重症。CA重复非12次时呼吸评分较高,提示病情较重,所以IL—4基因、IFN-γ基因个体差异可能决定着RSV感染后临床病情的不同。 5.IL-4基因—33C/T与—589C/T之间存在连锁不平衡,IL-4基因—33C/T与—589C/T构建的T/T单倍型与RSV感染易感性有关。Th1低活性Th2高活性基因型IFNγ(CA12-CA12-)/IL-4—589TT/—33TT为RSV毛细支气管炎易感的组合基因型。


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