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前体mRNA剪接蛋白ZNF265的表达、调控及功能研究

李静  
【摘要】: 锌指蛋白ZNF265(ZNF265,Zfp265,zis)于1997年由Karginova等人从大鼠的JG细胞(renal juxtaglomerular)中克隆到。JG细胞是位于肾动脉和肾小球紧密连接处的一类特化的肌内皮细胞,其主要功能是合成,分泌与储存肾素(renin)。作为肾素-血管紧张素系统(RAS)中的重要活性物质,肾素对于血管内血压及盐离子浓度的维持十分重要,然而关于JG细胞维持分化状态分泌肾素的分子机制却鲜有报导。ZNF265的mRNA存在于分化状态的具有分泌肾素功能的JG细胞中,但在非分化状态并且无分泌肾素功能的JG细胞中其表达消失。因此,ZNF265可能与JG细胞的分化状态和肾素分泌的功能相关。对ZNF265编码的序列分析表明,ZNF265具有两个新型的锌指结构,一个Ser-Are(SR)富集区,一个谷氨酸富集区和一个核定位信号(NLS)(图1),这些特征可能与前体mRNA剪接或成熟mRNA结合相关。2001年,Adams等人的研究发现,随着转染到细胞内的ZNF265表达质粒浓度的递增,ZNF265可以促使Tra-2β1前体mRNA第二、三个外显子的选择性剔除,导致截短型Tra-2β3剪接体增加。因此,ZNF265可能是一个参与选择性剪接的多功能蛋白,包括通过直接调节肾素前体mRNA的后加工过程或者通过对其他基因的调控间接影响JG细胞分化状态。 本文的主要目的是检测ZNF265在细胞、组织中的表达及ZNF265在具有局部肾素-血管紧张素的组织中的表达调控,研究ZNF265对于肾素及其它相关基因前体mRNA剪接影响并探索ZNF265在JG细胞的去分化过程中的功能。 首先我们通过RT-PCR等方法分析了ZNF265在人及小鼠各个组织中的表达谱,在小鼠的组织里,发现并克隆了ZNF265的一个新的亚型mZNF265-2,它在人体当中具有高度同源的对应体hZNF265-2。对ZNF265在不同组织的表达量的分析表明,ZNF265的两个亚型在人体及小鼠的各个组织当中均有表达,在20周的人胎组织中,ZNF265-1及ZNF265-2普遍表达,但表达水平随组织不同而有差异,如在大脑、小脑和肝组织中,两个亚型的转录体表达量基本相当(ZNF265-1/ZNF265-2的比值在0.9~1.1之间)。在心、肺、肠组织中,ZNF265-2的表达明显高于ZNF265-1的表达(ZNF265-1/ZNF265-2的比值在0.45~0.7之间);而在肾组织中,ZNF265-1的表达明显高于ZNF265-2的表达(ZNF265-1/ZNF265-2的比值为1.48)。相比之下,在小鼠的各个组织当中都以ZNF265-1的表达方式为主,且ZNF265-1相对与ZNF265-2的表达比例差异不大,大体为4:1左右。实验结果提示,ZNF265 mRNA的表达与所在组织的特异性密切相关,相对于小鼠,ZNF265 mRNA在人体当中的表达可能受到更复杂的调控。 为了分析ZNF265在人及小鼠不同组织中的蛋白表达,我们首先针对ZNF265及其两个亚型制备了特异的抗血清并通过ELISA、GST融合蛋白原核表达等实验鉴定这些抗血清的特异性。Western blot结果显示,ZNF265-1蛋白在受检的人及小鼠各个组织中均有表达,并且在小鼠不同发育阶段具有不同的表达特征:初生小鼠各个组织ZNF265蛋白表达差异较小,而在成年小鼠中,ZNF265在肾、肺和心肌组织中表达量较高,在脑、肝等组织中的表达量较低。此外,在受检的人胎儿及小鼠组织中,我们没有检测到ZNF265-2蛋白的表达。实验结果说明,在人类及小鼠组织中以ZNF265-1蛋白表达为主,ZNF265-2可能仅作为转录体存在并不表达蛋白,或表达量低于可检测范围。 作为一个参与选择性剪接的SR相关蛋白,ZNF265主要功能场所应该在细胞核内。用制备的兔抗ZNF265抗血清及Histag抗体,我们检测了内源性ZNF265蛋白及过表达ZNF265融合Histag蛋白在细胞内的表达,并观察了GFP融合ZNF265蛋白在COS1细胞内的表达分布。以上实验结果均表明,ZNF265主要在细胞核内分布,也验证了我们制备的兔抗ZNF265抗血清能用于免疫组化的检测。 由于ZNF265可能与肾素分泌相关,本文检测了ZNF265在具有局部肾素-血管紧张素的小鼠生殖系统内的表达分布及所受调控。通过免疫组织化学、精子免疫细胞化学等的方法对ZNF265在生殖系统中的分布进行检测,研究结果表明,ZNF265蛋白特异性地分布在雌鼠卵巢的透明带,黄体和髓质细胞的核内,雄鼠精子尾部的中段和附睾主细胞近腔面的紧密连接处。这些分布与肾素-血管紧张素系统中的血管紧张素Ⅱ的表达分布具有相似性。另外,以正常小鼠为对照,在去势小鼠内的附睾中,ZNF265表达大大降低,而补加了睾酮后,ZNF265的表达恢复到正常水平。这一调控现象,和已报道的血管紧张素及其受体在附睾内的调控表达具有类似性。研究结果提示,ZNF265可能参与了对肾素-血管紧张素系统中相关基因的调节,此可能性尚有待进一步研究。 相关报导表明,肾素在人体内有多个选择性剪接产物,分别为分泌型的肾型(Renin a)和不分泌型的脑型(Renin b)及肺型(Renin c)成熟转录体。作为前体mRNA的选择性剪接蛋白ZNF265,有可能通过对肾素前体mRNA的选择性剪接调控而参与调节肾素表达。因此我们构建了肾素小基因(ReninExon1-3)用于研究ZNF265是否对其具有选择性剪接的功能。其中外显子ReninExon1a和Renin Exon1c的选择性剪接为二者取一的模式,分别只存在于肾型和肺型的成熟转录体中。通过对肾素小基因剪接模型的研究表明,肾素小基因在体内的选择性剪接模式和细胞类型相关,ZNF265过量表达对肾素前体mRNA剪接模式没有影响。说明肾素的表达具有复杂的调控机制,与决定细胞类型的多种蛋白的综合作用相关。 考虑到ZNF265在体内各个组织中均有表达,可能具有广泛作用。本文还构建了FGF-2R、GluR-B、hZis、mZis等小基因,并研究了ZNF265对SMN2、CFTR等疾病相关基因的选择性剪接的影响,其中FGF-2R、GluR-B为神经系统特异表达基因;SMN2和CFTR在体内广泛表达,SMN2外显子7的选择性剃除与脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)临床表型的严重程度密切相关,CFTR的成熟转录体缺少Exon9会引起先天性双侧输精管缺失(Congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD);hZis、mZis小基因则包含了人或小鼠ZNF265的9~11外显子的基因组DNA片段,用于研究ZNF265的自调控功能。研究结果表明,ZNF265的过量表达对于FGF-2R前体mRNA剪接没有明显影响。对于GluR-B、SMN2、CFTR等小基因,ZNF265的过量表达分别能促进GluR-B外显子14、SMN2外显子7和CFTR外显子9的选择性剃除,即促进它们的前体mRNA的截短型剪接并且这些截短型剪接产物的比例增加为ZNF265蛋白浓度依赖型。此外,我们的研究发现,ZNF265-2的过量表达可改变对hZis、mZis小基因的剪接方式,提示该剪接蛋白可能参与对自身前体mRNA的剪接调控。 鉴于ZNF265具有典型的RNA结合结构域,以前的研究认为ZNF265可能与成熟mRNA结合。若ZNF265和JG细胞分化状态及肾素-血管紧张素系统的相关基因有表达调控的关系的话,ZNF265有可能通过与目标基因的mRNA结合调控目标基因的表达。鉴于诸多研究表明细胞周期蛋白调节因子和细胞分化状态有密切关系,本文用免疫共沉淀结合RT-PCR的方法不仅筛选了与ZNF265蛋白可能相结合的肾素-血管紧张素系统的相关基因的mRNA还筛选了与ZNF265蛋白可能相结合的多种细胞周期蛋白调节因子的mRNA。我们的研究表明,虽然ZNF265蛋白与肾素-血管紧张素系统的相关基因的mRNA没有直接结合的关系,但和细胞周期蛋白调节因子Cyclin B1、Cyclin D2的mRNA具有明显的结合关系,提示ZNF265对于细胞周期蛋白调节因子B1、D2的表达有调控关系。有证据表明,ZNF265蛋白家族的C4SR(爪蟾源)及Zfp265(大鼠源)在体外能和Cyclin B1转录体结合,这与我们的研究结果是一致的。细胞周期调节蛋白Cyclin B1和Cyclin D2与细胞的生长及分裂密切相关,在很多癌细胞和去分化细胞中都会过表达。因此ZNF265很可能通过参与对这些细胞周期调节蛋白mRNA稳定性或后加工等过程的调节而影响了JG细胞的去分化过程。 综上所述,本论文围绕ZNF265在前体mRNA剪接中的功能和机制这一大方向,进行了初步的探索,对ZNF265的亚型,发育调控,在细胞及组织内的表达,在具有局部肾素-血管紧张素系统内受到的调控,在前体mRNA选择性剪接中的功能及作用的下游基因进行了研究。研究结果提示,作为一个有多个功能域的锌指蛋白,ZNF265对于基因的选择性剪接、细胞的分化及癌症、个体的发生及发育均具有重要的生理意义。


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