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蛋白质的磁性微球快速酶解与高效富集新方法研究

李嫣  
【摘要】: 本论文针对蛋白质组学研究中面临的快速酶解以及磷酸化蛋白高效选择性富集方面的热点难点问题,将功能化磁性微球与蛋白质分析结合起来,开展了一系列研究工作,发展了相关的新技术新方法并进行了实际的应用研究,取得了一些创新性研究结果。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下: 第一章概述了蛋白质组学研究的现状,基于生物质谱的蛋白质组学研究技术以及新兴的翻译后修饰蛋白组学的重要意义;就目前固定化酶反应器及其在蛋白质组学研究中的应用,以及磷酸化蛋白质组学研究中的富集技术研究进展进行了综述;概述了功能化磁性微球及其在生物分析中的应用;最后提出了本论文选题的目的和意义。 第二章分别运用金属离子螯合和共价键合两条技术路线,合成了表面固定酶的磁性硅球材料并将其应用于毛细管/微流控芯片酶解反应器。首先,采用水热法制备了具有超顺磁性的四氧化三铁磁性微球;然后采用溶胶-凝胶法在其表面包覆二氧化硅层,合成了具有核壳结构的Fe_3O_4@SiO_2磁性硅球。在此基础上,发展了两条不同的固定酶的方法,即金属离子螯合法和共价键合法,将胰蛋白酶固定在磁性硅球表面。 利用外加磁场的作用,在不需要制作塞子的情况下,将用两种不同方法合成的固定酶的磁性硅球分别填充到毛细管或者微流控芯片通道内部。蛋白质溶液在泵的推动下,流过毛细管或者微流控芯片通道,从而得到快速的酶解。使用MALDI质谱对收集到的酶解产物进行分析鉴定。结果表明,用两种不同的固定酶方法制得的毛细管/微流控芯片酶反应器均能在5分钟的酶解时间内达到与12小时传统溶液酶解相同或更好的酶解效果。该方法易于操作、成本低;由于材料的磁性,毛细管/芯片通道内的磁性微球还可以进行方便快速地替换,很好地解决了以前文献报道中毛细管/芯片酶反应器只能一次性使用的缺点。对用金属离子螯合方法固定酶的磁性微球而言,还可以用EDTA将磁性微球表面的铜离子除去,再重新引入新的铜离子和蛋白酶,从而实现毛细管/微流控芯片酶反应器的再生。 第三章发展了更为简便的方法,运用一步水热法合成了氨基四氧化三铁磁性微球,从而将固定酶的磁性微球的合成步骤由第二章中的6步简化到3步,大大缩短了合成的时间。 在上述工作的基础上,将固定酶的磁性微球进一步应用于蛋白质的靶上酶解。将磁性微球分散液滴加到已经预先滴加好蛋白溶液的靶板上,酶解一段时间后,用磁化的钢针把固定酶的磁性微球从靶板上分离出来,从而终止酶解过程。这样,我们既利用了固定化酶技术提高了酶解效率,又避免了对质谱离子源光栅的污染。最后,为了证实本方法在复杂生物样品检测中的实际应用性,我们对大鼠肝脏提取蛋白的液相色谱流分就行了酶解鉴定。 第四章针对翻译后修饰蛋白质组研究中亟待解决的磷酸化蛋白及肽段的分离富集问题,用固定金属亲和色谱(IMAC)原理,在Fe_3O_4@SiO_2磁性硅球表面键合上可以螯合金属离子的官能基团,再将对磷酸化蛋白/肽段有特异性吸附作用的铈离子固定在磁球表面。由于材料的磁性,当磷酸化肽段富集到磁性微球上以后,只需将磁铁放置在盛放溶液的离心管外壁,就可以轻松实现富集了磷酸化肽段的磁性微球与非磷酸化肽段溶液的分离。文献调研显示,Fe~(3+)和Ga~(3+)是IMAC富集中最常使用的金属离子,而目前尚未有将Ce~(4+)成功地应用于磷酸化肽富集的文献见诸报道。因此,在本论文中,我们还进一步比较了螯合Ce~(4+)的磁性微球与螯合Fe~(3+)的磁性微球对磷酸化肽段的富集效率。结果表明,螯合Ce~(4+)的磁性微球对复杂混合物中磷酸化肽段的选择性富集效果优于螯合Fe~(3+)的磁性微球。即使在酶解肽段溶液中BSA的量是β-casein的量的50倍的情况下,螯合Ce~(4+)的磁性微球仍可在30 s内将β-casein中的痕量磷酸化肽段有效地富集出来。在此基础上,我们还首次成功地将螯合Ce~(4+)的磁性微球用于选择性富集人血清中(不需要其它的预处理步骤)的磷酸化肽段,为磷酸化蛋白质组学的研究开辟了新的道路。 第五章创新性地探索了在四氧化三铁磁性微球表面均匀包覆过渡金属氧化物的新方法。采用磁球外部包覆碳层为模板包覆过渡金属氧化物、随后灼烧去除碳层的方法,制备了结构紧密的具有核壳结构的Fe_3O_4@M_xO_y超顺磁性微球。该磁性微球具有与IMAC材料不同的富集机理,具有更高的化学惰性和稳定性。利用该方法将不同的过渡金属氧化物,如Al_2O_3,ZrO_2,Ga_2O_3等分别包覆到四氧化三铁磁性微球表面。采用振动样品磁场计、傅立叶变换红外光谱仪、透射及扫描电子显微镜等对产物进行了表征与确认。我们进而优化了这些材料富集磷酸化肽段的实验条件,包括富集体系、富集时间、样品洗脱时间等,验证了表面包覆不同金属氧化物的Fe_3O_4@M_xO_y磁性微球对于复杂体系中的磷酸化肽段均有很好的选择性富集效果,并进一步将其应用于人血清及脱脂牛奶、鼠肝蛋白酶解产物中磷酸化肽的富集鉴定。 总之,本论文针对蛋白质组学研究中面临的快速酶解与高效富集方面的热点难点问题,以功能化磁性微球为基础,以发展相关的蛋白质组学研究新技术新方法并进行实际的应用研究为目标,合成了多种表面带有不同功能基团的磁性微球并建立了相应的分析方法,为解决蛋白质快速酶解、磷酸化肽段高效分离富集及鉴定等问题提供了新颖有效的研究手段和方法。


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