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过表达p53对机械刺激导致的心肌细胞肥厚的影响

胡海锋  
【摘要】: 心肌肥厚是临床常见心血管疾病的并发症。早期的代偿性心肌肥厚能够缓解心室壁的张力,增加心脏输出量,持续性心肌肥厚最终导致心脏扩张,随之而致的就是临床上心衰和猝死的发生。临床研究证实,心肌肥厚是心脏疾病病残率和病死率的独立危险因素。 循环超负荷对心脏构成机械刺激,它是导致心肌肥厚发生的首要因素。蛋白激酶ERK信号通路在心肌肥厚的发生机制上发挥重要作用。高表达MEK1的转基因小鼠ERK_(1╱2)异常激活,其心肌出现明显的肥厚特征。主动脉缩窄造成的急性压力超负荷也能导致大鼠心肌ERK_(1/2)的异常激活。综合以上结论,ERK_(1╱2)是机械因素导致心肌肥厚的重要细胞内信号转导分子。 P53作为一个经典的抑癌基因,其在恶性肿瘤方面的研究是其热点。目前有关P53在心血管领域作用的研究主要集中在关于其与各种刺激因素引发的细胞凋亡的相关性方面。有报导显示在整体心脏水平P53通过抑制Hif-1从而减少VEGF等血管生长因子的表达,进而抑制血管新生,最终起到抑制心肌肥厚并导致心脏功能障碍的作用。而心肌细胞本身也少量表达p53,可能与心肌细胞的DNA合成、细胞分裂周期调控相关,而与心肌细胞肥厚发生发展的直接关系尚不明确。 本实验的目的是观察P53是否直接与离体心肌细胞肥厚反应相关。如前所述,因为ERK_(1╱2)是机械因素导致心肌细胞肥厚的重要细胞内信号转导分子,所以我们以p-ERK_(1/2)作为心肌细胞肥厚的标记。本实验分为两部分,第一部分,在对培养在硅胶板上的心肌细胞进行不同时间的牵张后,通过Western Blot检测磷酸化ERK_(1/2),观察其随牵张时间不同表达变化的规律。由于心肌细胞本身表达的p53量较少,而且不易检测,所以第二部分则是先行心肌细胞内p53基因转染使其高表达p53蛋白,再不同时间牵张心肌细胞,Western Blot检测p-ERK_(1/2)随时间不同表达变化规律的改变,最后通过比较两部分实验结果,推测P53在机械刺激导致的心肌细胞肥厚发生发展中的可能作用。 第一部分机械牵拉引起培养心肌细胞内磷酸化ERK_(1/2)表达变化的时间依赖性。 目的:观察牵拉不同时间后培养心肌细胞内p-ERK_(1/2)表达的变化。 方法:1-3天SD乳鼠来源的原代培养的心肌细胞接种在硅胶板上,经10%FBS的DMEM培养液培养24h后换无血清DMEM培养液,培养72h后同批培养的心肌细胞分成不牵张,以及牵张5min、10min、30min、1h和2h六组,各自予以相应牵张处理,然后提取细胞总蛋白,Western检测p-ERK_(1/2)。 结果:心肌细胞p-ERK_(1╱2)的表达在牵拉后5分钟即明显增加,与未牵张组比较达到统计学差异(P<0.05)。p-ERK_(1/2)的表达在其后的牵张中,随牵张时间的延长而递增。 结论:机械牵张可以激活ERK信号通路,且有时间依赖性。ERK是机械牵张引起心肌细胞肥厚发生发展的重要信号传导通路。 第二部分高表达p53蛋白对不同时间机械牵张引起的心肌细胞内磷酸化ERK1/2表达的影响。 目的:观察p53基因转染心肌细胞后,高表达p53蛋白对牵拉引起的培养心肌细胞内p-ERK_(1/2)表达变化的影响。 方法:(1)先将1-3天乳鼠来源的心肌细胞接种在硅胶板上,经10%FBS的DMEM培养液培养24h后换无血清DMEM培养液,按MOI(感染复数,multiplyof infection)为10、20、40、80、160加入p53-Adv,在血清肌饿状态下转染24h,提取细胞总蛋白,Western检测p53蛋白表达以确立最佳的MOI。(2)原代培养的心肌细胞接种在硅胶板上,经10%FBS的DMEM培养液培养24h后换无血清DMEM培养液。按80MOI加入p53-Adv,在无血清DMEM状态下转染24h后,分成不牵张,以及牵张5min、10min、30min、1h和2h六组,各自予以相应牵张处理,然后提取细胞总蛋白,Western检测p-ERK_(1/2)。 结果:(1)MOI为80时p53-Adv转染心肌细胞可以达到明显的转染效果,p53表达明显增加。(3)p53的过表达对于5分钟短期牵张后心肌细胞的p-ERK_(1╱2)表达增加无抑制作用,和未牵张组对比仍有统计学意义的升高(P<0.05),但对此后稍长时间牵拉的各组p-ERK_(1╱2)表达的抑制作用明显,各牵张组与5min牵张组比较其表达下降程度达统计学差异(P<0.05),2h牵张组p-ERK_(1╱2)表达最低,和其他各组比较均有统计学意义(P<0.05)。 结论:p53过表达对于牵拉心肌细胞后短期(5分钟)的p-ERK_(1/2)表达增加无抑制作用,对牵拉5分钟以后的p-ERK_(1/2)表达增加有明显抑制作用,提示在持续机械刺激时p53可能通过直接抑制较晚期的心肌细胞肥厚反应而参与了心肌由代偿期向失代偿期的转化过程。


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