Neuroserpin在神经元和小胶质细胞缺氧复氧损伤中的作用研究

【摘要】： 第一部分、Neuroserpin和tPA在神经元缺氧复氧不同时间段的动态表达 目的：研究在正常和缺氧复氧的条件下神经元合成神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Neuroserpin、NSP)和组织型纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator、tPA)的量以及它们在缺氧复氧时的动态变化。 方法：体外原代培养大鼠皮层神经元并鉴定。建立缺氧复氧(hypoxia／reoxygenation、H／R)模型。使用免疫荧光双标染色、Western-blot法检测神经元在缺氧、缺糖(Oxygen—glucose deprivation、OGD)1．5h和不同复氧时间段释放NSP的量，使用ELISA法检测同样条件下释放tPA的含量，观察它们表达的动态变化。 结果：1、在缺氧90 min，复氧6 h后，神经元胞体肿胀，MAP-2免疫荧光染色显示部分神经元轴突呈串珠样改变或断裂，活细胞计数试剂盒(Cell CountingKit-8，CCK-8)结果表明此时神经元存活率下降至正常培养状态下的50％左右。2、免疫荧光染色法观察到在正常培养的神经元中可见有明显的NSP表达；缺氧复氧损伤后神经元仍可见明显的NSP的表达。Western blot结果进一步显示：正常培养的神经元已有较高水平的NSP蛋白的表达，OGD 1．5h后蛋白表达量轻度上调，复氧6 h时达到高峰(为缺氧前水平的3．29倍)，差别具有显著性意义(P＜0．05)。之后NSP蛋白表达水平缓慢下降，复氧24h时基本回到缺氧前水平。3、ELISA结果显示：正常神经元tPA含量基本测不出，OGD1．5h时，细胞可以表达少量的tPA(P＜0．05)。随着复氧时间的增加，tPA有增加的趋势。到复氧6h时，tPA的含量较缺氧前有明显提高(P＜0．01)，随后含量逐步减少，到复氧24h时基本回到OGD1．5h复氧0h的水平。 结论：神经元缺氧复氧模型有效。NSP和tPA在神经元缺氧复氧损伤时表达量均有明显上调，并且两者在动态变化上基本一致。 第二部分、Neuroserpin在神经元缺氧复氧损伤中的保护作用 目的：观察tPA对体外不同条件培养的神经元损伤作用，探讨NSP是否可以减轻tPA对神经元的损伤。 方法：体外原代培养大鼠皮层神经元并鉴定。建立缺氧复氧(hypoxia／reoxygenation、H／R)模型。首先检测tPA对于神经元的损伤作用。1、不同浓度tPA干预正常神经元不同时间：随机将细胞分为正常组、PBS干预组和tPA干预组，分别干预神经元不同时间(0．5h、1h、4h、6h、8h和124h)。2、tPA在缺糖缺氧前干预神经元：将细胞分为正常组、H／R组(OGD1．5h复氧4h)、PBS+H／R组、tPA+H／R组。即PBS和tPA干预神经元4小时后OGD1．5h复氧4h。3、tPA在缺糖缺氧后干预神经元：细胞随机分为H／R组(OGD1．5h复氧组)、H／R±PBS组、H／R+tPA组。即PBS和tPA在OGD1．5h加入，然后复氧0．5h、1h、4h、6h。tPA分为4个不同浓度组(终浓度分别为0．01、0．05、0．075、0．1μg／μL)。均用CCK-8检测各组间细胞存活率。 其次检测NSP对于神经元的作用：1、NSP在缺糖缺氧前干预神经元：细胞随机分为H／R组(OGD1．5h复氧4h)，PBS+H／R对照组(PBS干预细胞4小时后OGD1．5h复氧4h)，tPA+H／R组(tPA干预4h后OGD1．5h复氧4h)，NSP+tPA+H／R组(NSP预处理正常神经元0．5h后，加tPA共同培养4h，再进行OGD1．5h复氧4h)。利用MAP-2染色在荧光显微镜下直接观察神经元形态的变化、CCK-8法测定细胞存活率、LDH法测定细胞损伤程度和Tunel染色(DAB)测定凋亡率。2、NSP在缺糖缺氧后干预神经元：细胞分为H／R组(OGD1．5h复氧4h)、H／R+PBS组(OGD1．5h即刻加入PBS后复氧培养4h)、H／R+tPA组(OGD1．5h时即刻加入tPA后复氧培养4h)，H／R+tPA+NSP组(OGD1．5h时即刻加入tPA干预0．5h后，再加入NSP共同培养4h)和／R+NSP组(OGD1．5h时即刻加入NSP复氧培养4h)，检测指标同前部分。 结果：1、tPA对正常条件培养的神经元具有毒性作用，生存率有随时间变化的趋势，并且干预时间的作用随着干预药物浓度的不同而不同。2、tPA在缺糖缺氧前干预神经元会加重神经元的损伤。3、tPA在缺糖缺氧后干预神经元，其细胞生存率仍有随时间变化的趋势，并且干预时间的作用随着干预药物浓度的不同而不同。即tPA会加重细胞的缺氧复氧损伤，并且随着tPA浓度的增加和复氧时间的延长，这种损伤会加重。4、NSP在缺糖缺氧前或后干预神经元均都可以抑制tPA的作用。 结论：tPA对体外培养的正常神经元有毒性作用，细胞存活率与tPA干预的剂量与时间呈负相关。tPA可加重OGD—复糖复氧神经元的损伤，细胞存活率仍与tPA干预的剂量与时间呈负相关。NSP在不同条件下均可减轻tPA对神经元的毒性损伤而起到保护神经元的作用。 第三部分、Neuroserpin干预后的小胶质细胞对神经元的作用 一、Neuroserpin在小胶质细胞缺氧复氧模型上的作用 目的：观察组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)对体外不同条件培养的小胶质细胞(Microglia，MG)的作用。探讨神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Neuroserpin，NSP)是否可以改变tPA对MG的影响。 方法：体外原代培养大鼠皮层小胶质细胞并鉴定。建立缺氧复氧(hypoxia／reoxygenation、H／R)模型。首先使用ELISA试剂盒测定小胶质细胞在缺氧复氧状态下自身释放tPA的含量。其次研究Neuroserpin在小胶质细胞缺氧复氧时的作用，实验分三大组：第一大组为缺氧复氧干预组：分为正常组、PBS对照组、OGD3h复氧不同时间组(复氧1h、3h、5h、7h和24h)；第二大组为tPA干预组：分为正常组、PBS对照组、不同浓度tPA组(终浓度为0．01、0．025、0．05、0．075和0．1μg/μl干预24h)；第三大组为NSP预处理组：分为正常组、PBS对照组、tPA组(终浓度为0．05μg／μl的tPA干预24h)、NSP+tPA组(终浓度0．025μg/μl的NSP预处理0．5h后，终浓度为0．05μg／μl的tPA干预24h)、OGD3h组、tPA+OGD3h组(终浓度为0．05μg/μl的tPA干预24h后OGD3h)、NSP+tPA+OGD3h组(NSP预处理0．5h后终浓度0．051μg／μl的tPA干预24h，OGD3h)。分别采用倒置相差显微镜直接观察细胞形态学变化、CCK-8法检测各组间细胞增值率，ELISA试剂盒测定IL-1β和NO含量。 结果：1、MG在H／R时合成tPA，OGD3h复氧3h时释放量最多。2、H／R时MG激活，炎性因子IL-1β和NO的释放增多。3、tPA干预MG后，细胞激活和增殖、IL-1β和NO的释放增多。4、各NSP预处理组细胞激活、增殖和炎性因子的释放增多均没有tPA或H／R干预组明显。 结论：MG在H／R时合成tPA。H／R早期即诱发了MG的活化。tPA可以进一步诱发MG的增殖和活化。H／R和tPA引起IL-1β和NO的释放。NSP可以减轻缺氧复氧和tPA干预引起的MG的活化和增殖，并且可以减少小胶质细胞IL-1β和NO的释放。 二、小胶质细胞条件培养液对神经元的作用 目的：探讨NSP是否通过影响小胶质细胞而对神经元起保护作用。 方法：体外原代培养大鼠皮层神经元和小胶质细胞并分别鉴定。分别建立缺氧复氧(hypoxia／reoxygenation、H／R)模型。制备小胶质细胞条件培养液(conditioned medium，CM)，分为1、不加任何干预的小胶质细胞条件培养基(N-CM)；2、PBS干预的小胶质细胞条件培养基(PBS-CM)；3、OGD3h复氧1h、3h、5h、7h、24h刺激所得条件培养基(H／R-CM)；4、终浓度为0．025μg／μL的NSP预处理0．5h后缺氧复氧刺激所得条件培养液(NSP+H／R-CM)；5、加入不同终浓度tPA(0．01、0025、0．05、0．075、0．1μg／μL)刺激后所得条件培养基(tPA-CM)；6、终浓度为0．025μg／μL的NSP预处理0．5h后加入tPA刺激所得条件培养液(NSP+tPA—CM)。采用免疫荧光染色后MAP—2标记观察神经元的形态学变化、CCK-8法测定神经元存活率、LDH释放试验测定细胞毒性、凯基活细胞／凋亡细胞／坏死细胞鉴别试剂盒测定细胞凋亡率和坏死率和Tunel试剂盒(DAB染色)测定细胞凋亡率。 结果：缺氧复氧组制成的小胶质细胞条件培养液对于神经元有较强的损伤作用，主要引起细胞的坏死。当OGD3h时这种损伤作用已经很明显，并且随着复氧时间的延长，损伤作用增加(P＜0．05)。tPA组制成的小胶质细胞条件培养液对神经元也有损伤的作用，主要引起细胞的凋亡，终浓度为0．01μg/μL时损伤作用较轻，但随着tPA浓度的增加，损伤作用明显增加(P＜0．05)。各NSP预处理组细胞的损伤与无NSP组比较均减轻(P＜0．05)。 结论：缺氧复氧或tPA干预后制备的小胶质细胞条件培养液对神经元均有损伤作用，NSP预处理后可以减轻这些损伤。 第四部分Neuroserpin保护作用的机制研究 目的：观察小胶质细胞激活的主要信号传导途径，探讨NSP通过tPA抑制小胶质细胞进而产生神经保护作用的可能机制。 方法：体外原代培养大鼠皮层小胶质细胞并鉴定，建立OGD模型。细胞随机分为：正常组、tPA组(终浓度为0．05μg／μL、干预细胞24h)、OGD3h组、NSP+tPA组(0．025μg／μL的NSP预处理0．5h后，0．05μg/μL的tPA干预24h)和NSP+OGD3h组(终浓度为0．025μg／μL的NSP预处理0．5h后，OGD3h)。使用免疫荧光双标染色方法检测各干预组MAPK通路磷酸化蛋白的表达情况，Western-blot法进一步检测各组MAPK通路磷酸化蛋白的表达量变化。免疫荧光双标染色方法检测各干预组核转录因子κB的核移位情况。 结果：免疫荧光双标染色提示，小胶质细胞在正常状态下有少量ERK1／2以及P38通路磷酸化蛋白的表达，在tPA和OGD干预后磷酸化蛋白的表达明显增高。进一步使用Western blot结果分析：tPA和OGD干预组ERK1／2和P38通路的磷酸化水平较正常组比较均有明显增高，其中ERK1／2磷酸化水平增高更显著(P＜0．01)。NSP预处理组磷酸化水平较干预组降低。小胶质细胞在正常和干预状态下均有JNK通路磷酸化蛋白较高量的表达，进一步使用Western blot结果分析：tPA和OGD干预后磷酸化蛋白的表达量也有轻度的增高，NSP预处理组表达降低。 免疫荧光双标染色提示：在正常小胶质细胞中NF-κB主要存在于细胞胞浆中，在tPA和OGD干预后，NF-κB发生明显的核移位现象，主要在细胞核表达。各NSP预处理组NF-κB核移位现象明显减轻。 结论：Ras／ERK，JNK／SAPK和P38通路对于小胶质细胞在tPA和OGD干预后的激活均起了一定的作用，其中ERK1／2和P38发挥了更重要的作用。tPA和OGD干预小胶质细胞后，NF-κB发生明显的核移位，此通路被激活。NSP预处理各干预组后，各条信号通路均被不同程度抑制。 结论 1、NSP和tPA在缺氧复氧损伤时表达量均有明显上调，并且两者在动态变化上基本一致。 2、tPA对体外培养的正常神经元有毒性作用，tPA可加重OGD—复糖复氧神经元的损伤。 4、NSP可减轻tPA对神经元的毒性损伤而起到保护神经元的作用。 5、小胶质细胞在H／R时自身可以合成tPA。 6、缺氧复氧早期即诱发了小胶质细胞的活化。tPA可以进一步诱发MG的增殖和活化。缺氧复氧和tPA均可以引起小胶质细胞IL-1β和NO的释放。 7、NSP可以减轻缺氧复氧和tPA干预引起的MG的活化和增殖，并且可以减少MG的IL-1β和NO的释放。 8、缺氧复氧和tPA干预后制成的小胶质细胞条件培养液对神经元均有损伤作用，NSP可以减轻这些损伤。 9、MAPK通路对于小胶质细胞在tPA和OGD干预后的激活有作用，其中ERK1／2和P38发挥了更重要的作用。tPA和OGD干预小胶质细胞后，NF-κB发生明显的核移位，此通路被激活。NSP预处理各干预组后，各条信号通路均被不同程度抑制。