收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

细胞周期蛋白Hcdc14A在高糖和高游离脂肪酸及低氧联合刺激诱导脑血管内皮细胞损伤中的调控机制研究

周厚广  
【摘要】: 第一部分 高糖、高游离脂肪酸和低氧刺激对Hcdc 14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响 目的:观察高糖、高游离脂肪酸(FFA)和低氧刺激对人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。 方法:分别采用不同条件的高糖、高FFA和低氧刺激人脑血管内皮细胞:RT-PCR和Western-blot检测Hcdc14A的mRNA和蛋白表达;Western-blot检测相关周期蛋白cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达;XTT法和CCK8法测定细胞增殖率和存活率;流式细胞术和caspase3活性检测法观察细胞凋亡;流式细胞术观察细胞周期;荧光探针观察细胞骨架蛋白F-actin空间结构;电镜观察细胞超微结构。 结果:1.高糖、高FFA和低氧刺激均可明显下调人脑血管内皮细胞Hcdc14A的mRNA和蛋白表达。2.高糖、高FFA和低氧刺激均可下调cyclinB、cyclinD和cyclinE蛋白表达,上调P53蛋白表达。3.高糖、高FFA和低氧刺激均使细胞增殖率和存活率下降。4.高糖、高FFA和低氧刺激均使细胞凋亡率增加,Caspase-3活性增强。5.高糖、高FFA和低氧刺激均明显下调细胞周期中S期和G2-M比例。6.高糖、高FFA和低氧刺激均对细胞骨架蛋白F-actin空间结构产生一定影响。7.电镜观察发现高糖、高FFA和低氧刺激后凋亡细胞增多,联合刺激组凋亡小体形成较明显。 结论:高糖、高FFA和低氧刺激均可明显下调人脑血管内皮细胞Hcdc 14A和相关周期蛋白表达,阻滞细胞周期,降低细胞增殖率,诱导细胞凋亡,并对细胞骨架蛋白F-actin空间结构和细胞超微结构产生一定影响,三者联合刺激上述作用最为明显。 第二部分 过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响 目的:观察过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建Hcdc14A真核表达载体并转染HEK293细胞和Hela细胞;共聚焦显微镜观察Hcdc14A在细胞分裂期的定位;Western-blot检测重组质粒转染后Hcdc14A表达效率及其过表达对cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达的影响;CCK8方法检测重组质粒转染并给予高糖、高FFA和低氧联合刺激后的细胞存活率;流式细胞术和caspase3活性测定法观察转染和联合刺激后的细胞凋亡;流式细胞术观察转染和联合刺激后的细胞周期;荧光探针观察转染和联合刺激后细胞骨架蛋白F-actin空间结构;电镜观察转染和联合刺激后的细胞超微结构。 结果:1.成功构建并转染Hcdc14A真核表达载体(pEGFP-C2-Hcdc14A质粒),重组质粒转染后Hcdc 14A表达显著上调,发现其在细胞分裂期定位于纺锤体两极和中心体上。2.重组质粒转染后Hcdc14A表达显著上调,同时cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达均不同程度上调。3.转染后细胞增殖率明显增加。4.转染后caspase3活性有所增强。5.转染后细胞周期S期和G2-M比例明显增加。6.转染后细胞骨架蛋白F-actin出现解聚样改变。7.电镜观察发现转染后少部分细胞呈现肿瘤化改变。 结论:过表达Hcdc14A可同时上调cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达,加速细胞周期进程,提高细胞增殖率,促进细胞骨架蛋白F-actin解聚,同时也可能影响细胞凋亡进程。提示过表达Hcdc14A可同时影响相关周期蛋白表达和细胞周期进程,进而影响细胞的增殖和凋亡进程。 第三部分 siRNA干扰Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响 目的:观察siRNA干扰Hcdc14A基因表达对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。 方法:设计合成3对靶向Hcdc14A特定序列的siRNA并转染细胞:RT-PCR和Western-blot验证Hcdc14A表达;Western-blot检测siRNA干扰对cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达的影响;CCK8方法检测siRNA干扰后的细胞存活率;caspase2活性测定法观察siRNA干扰后的细胞凋亡;流式细胞术观察siRNA干扰后的细胞周期;荧光探针观察siRNA干扰后的细胞骨架蛋白F-actin空间结构;电镜观察siRNA干扰后的细胞超微结构。 结果:1.siRNA能显著下调Hcdc14A的mRNA和蛋白表达水平。2.siRNA干扰还可同时下调cyclinB和cyclinD蛋白表达,上调P53蛋白表达,对cyclinE无明显影响。3.siRNA干扰后细胞存活率明显下降。4.siRNA干扰后细胞凋亡明显增加。5.siRNA干扰后细胞周期中S期和G2-M比例明显减少。 6.siRNA干扰后细胞骨架蛋白F-actin呈现一定聚合样改变。7.电镜观察发现siRNA干扰后凋亡细胞增多。 结论:siRNA干扰Hcdc14A基因表达的同时还可影响相关周期蛋白cyclinB、cyclinD和P53的表达,阻滞细胞周期进程,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并可能对骨架蛋白F-actin空间结构产生一定影响。提示下调Hcdc14A基因表达可能引起整个细胞周期调控网络功能紊乱,导致细胞正常生理功能发生改变。 第四部分 G-CSF对Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响及其细胞保护作用机制 目的:观察G-CSF对人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响,初步探讨G-CSF对联合刺激后人脑血管内皮细胞的保护作用及其机制。 方法:不同条件G-CSF刺激人脑血管内皮细胞,CCK8法和caspase3活性测定法观察G-CSF对细胞增殖和凋亡的影响;XTT法和CCK8法检测G-CSF预处理不同时间对高糖、高FFA和低氧联合刺激后细胞增殖率和存活率的影响;Western-blot检测G-CSF预处理对Hcdc14A及相关周期蛋白表达的影响;流式细胞术和caspase3活性测定法观察G-CSF预处理对细胞凋亡的影响;流式细胞术检测G-CSF预处理对细胞周期的影响;荧光探针观察G-CSF预处理对细胞骨架蛋白F-actin空间结构的影响:电镜观察G-CSF预处理对细胞形态学的影响;荧光探针检测G-CSF预处理对活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、钙离子(Ca~(2+))及线粒体膜电位(MMP)等氧化应激相关指标的影响;ELISA和免疫荧光等方法检测G-CSF预处理对PI3K/AKT和MAPK信号通路的影响。 结果:1.G-CSF刺激可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。2.G-CSF预处理12h可明显提高联合刺激后的细胞增殖率和存活率。3.G-CSF能够明显上调Hcdc14A、cyclinB和cyelinE蛋白表达,下调P53蛋白表达,对cyclinD无明显影响。4.G-CSF预处理可明显抑制联合刺激诱导的细胞凋亡。5.G-CSF预处理可上调S期和G2-M期细胞比例。6.G-CSF预处理可促进细胞骨架蛋白F-actin解聚。7.电镜观察发现G-CSF预处理后凋亡细胞有所减少。8.G-CSF预处理可明显拮抗联合刺激诱导的氧化应激,上调NO、eNOS和MMP水平,降低ROS和Ca~(2+)水平。9.G-CSF可激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,并抑制JNK和p38信号通路。 结论:G-CSF能够上调Hcdc14A和相关周期蛋白cyclinB、cyclinE蛋白表达,下调P53蛋白表达,调控细胞周期进程,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,拮抗高糖、高FFA和低氧联合刺激诱导的氧化应激,并可激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,抑制JNK和p38信号通路。提示G-CSF可能是通过调控Hcdc14A和相关周期蛋白表达、拮抗氧化应激、影响PI3K/AKT和MAPK信号通路等多种机制发挥其内皮细胞保护作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 马强;耿焱;黄茂梁;吴英松;李明;;梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定[J];热带医学杂志;2011年06期
2 胡艳秋;;人RGS22蛋白表达及多克隆抗体制备[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年09期
3 孙佳;黄欣;朱玲玲;吴奎武;范明;;急性低氧对小鼠黏附分子CHL1组织水平表达的影响[J];中国应用生理学杂志;2011年03期
4 窦洪涛;张清华;朱旭东;党颖;徐龙;李涛;王林萍;董晓文;;37LRP基因表达载体构建及蛋白表达的研究[J];中国妇产科临床杂志;2011年04期
5 ;复旦大学附属儿科医院2011年国家级继续医学教育项目[J];中国循证儿科杂志;2011年05期
6 廖明;莫财锋;周怡;何敏;卓朗;;鸡尾酒疗法对大鼠肝星状细胞的纤维化相关基因表达和蛋白谱的影响[J];世界华人消化杂志;2011年17期
7 王惠榕;高岚美;萧剑雄;严延生;张春阳;;肺炎支原体ORF6区蛋白重组抗原制备及在血清学诊断中的初步应用[J];中国人兽共患病学报;2011年07期
8 刘秋均;李洪;杨烨;张春燕;;小鼠H22肝癌细胞中高表达膜蛋白的初步分析(英文)[J];泸州医学院学报;2011年05期
9 洪文艳;王浩然;王津;郭兆彪;周蕾;杨瑞馥;;鼠疫菌PsaA抗原的表达及抗体制备和应用[J];现代生物医学进展;2011年12期
10 ;复旦大学附属儿科医院2011年国家级继续医学教育项目[J];中国循证儿科杂志;2011年04期
11 阮建波;康东平;;乳腺癌手术标本BRCA-1蛋白表达与HER-2基因扩增的临床意义[J];求医问药(下半月);2011年03期
12 刘世敏;夏勇;李艺;何金森;施征;吴焕淦;崔学军;;Effects of Electroacupuncture on bcl-2 and bcl-XL in the Degenerative Cervical Intervertebral Disc of Rats[J];Journal of Acupuncture and Tuina Science;2009年06期
13 桂蜀华;王贵均;熊艺花;赖小平;;狭基线纹香茶菜对免疫性肝损伤小鼠TNF-α mRNA和蛋白表达水平的影响[J];中药药理与临床;2011年04期
14 刘永国;王勤章;丁国富;刘新军;周建民;李应龙;王江平;钱彪;杨兰;;干细胞因子对高糖环境下豚鼠膀胱Cajal样间质细胞c-kit mRNA及蛋白表达的影响[J];临床与实验病理学杂志;2011年03期
15 何太平;梁念慈;;重组人PRL-3蛋白的表达、鉴定和酶动力学分析[J];广东医学院学报;2011年04期
16 张懿;刘刚;;大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达[J];实用预防医学;2011年08期
17 张伟;杨文增;申岩;张彦桥;马涛;崔振宇;;HIF-1α和PTEN基因在肾细胞癌中表达的相关性及临床意义[J];现代肿瘤医学;2011年07期
18 占春玲;吴保平;张亚历;;β-catenin基因在Peutz-Jeghers综合征组织中的突变及表达[J];世界华人消化杂志;2011年16期
19 李冬霞;司艳莉;邓晓慧;冯艳玲;;52例胃癌组织中Survivin和Bcl-2蛋白表达研究[J];重庆医学;2011年22期
20 李辉;朱顺法;朱慧民;朱天民;;红豆杉多糖对比格犬心肌缺血再灌注损伤模型心肌细胞凋亡及FasmRNA和蛋白表达的影响[J];中华中医药杂志;2011年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王光春;郑军华;段强林;许云飞;鄢阳;高其若;;CO_2气腹对肾细胞癌中肿瘤转移相关基因和蛋白表达的影响及其机制[A];第十六届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2009年
2 宁博;;CyclinG1、G2蛋白表达与喉癌的相关性研究[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
3 德里达;张宁;;教授的未来和无条件大学——在复旦大学的演讲[A];当代国外马克思主义评论(第三辑)[C];2002年
4 曹梦;于艳雪;刘玉方;刘华贵;赵兴波;;双向电泳和MALDI-TOF分析三个鸡品种肌肉组织蛋白表达[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
5 黄慧妙;章斌;;125Ⅰ标记反义肽核酸抑制SKOV3细胞CerbB-2mRNA和Her-2蛋白表达的初步实验[A];第四届长三角妇产科学术论坛暨浙江省2009年妇产科学术年会论文汇编[C];2009年
6 刘晓健;扬文涛;周晓燕;陆洪芬;施达仁;李进;;IκBα在霍奇金淋巴瘤中的表达[A];2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2007年
7 阳敏燕;;RAE、VPA对LPS海马C-fos蛋白表达的影响及意义[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
8 张鲁伟;周荣祥;綦海燕;孙小庆;白鑫;韩保健;杨荣辰;王鹏;;膀胱移行细胞癌中△Np63和MDM2蛋白表达及其意义[A];第七次中国中西医结合泌尿外科学术年会暨第二次广东省中西医结合泌尿外科学术年会论文集[C];2009年
9 刘心;余景星;;多西他赛诱导HL60/ADR细胞凋亡及对P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
10 裘云庆;徐丽倩;马英玉;李继承;陈海啸;林爱芬;;sFRP1基因遗传不稳定性可作为中国人肝癌预后的指标[A];第十八次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王育蓉;人系膜细胞中TNFα促进IP_3R1的表达及相关信号传导通路的研究[D];中国医科大学;2010年
2 彭翔;PI3K/Akt信号通路在腹膜间皮细胞转分化中的作用及机制研究[D];中南大学;2010年
3 周厚广;细胞周期蛋白Hcdc14A在高糖和高游离脂肪酸及低氧联合刺激诱导脑血管内皮细胞损伤中的调控机制研究[D];复旦大学;2009年
4 何津岩;人类p100蛋白对HeLa细胞周期的影响及其机制研究[D];天津医科大学;2008年
5 曲银娥;COXⅦa在中老年男子部分雄激素缺乏综合征中的作用及机理研究[D];河北医科大学;2010年
6 曾郁;HOXA5基因在人类乳腺癌发病机制和治疗中的意义[D];复旦大学;2005年
7 刘红春;RIP2小干扰RNA表达质粒对小鼠巨噬细胞及内毒素血症的影响[D];复旦大学;2007年
8 邱瑾;氧糖剥夺对Cdh1蛋白表达的影响及其在星形胶质细胞反应性增殖中的作用研究[D];华中科技大学;2012年
9 徐可;缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在人肾癌中的表达及其功能的研究[D];复旦大学;2007年
10 周恒花;HNPCC家系hPMS2基因胚系突变及BRAF/KRAS基因突变在HNPCC筛选中的意义[D];复旦大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 柴红丽;Rho BTB2在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义[D];中南大学;2012年
2 李能芳;抗战时期复旦大学办学研究[D];西南大学;2010年
3 贾小英;组织蛋白酶L介导Ox-LDL诱导单层HUVECs通透性增加及其机制探讨[D];南华大学;2012年
4 林小花;结核分枝杆菌H37Rv邻氨基苯甲酸合成酶元件Ⅰ的表达、纯化和特性研究[D];复旦大学;2009年
5 陈夏;骨关节炎关节软骨细胞Fas基因异常甲基化及蛋白表达的实验研究[D];中南大学;2010年
6 赵静静;结核分枝杆菌H37Rv色氨酸合成酶α和β亚基的酶学性质及结构分析[D];复旦大学;2008年
7 孙丽;pESP15b/pARA-SP6表达载体的构建及应用研究[D];大连理工大学;2005年
8 覃健敏;IGF-1R基因多态性及p16、p21蛋白水平与巴马长寿关系的研究[D];广西医科大学;2011年
9 谢奎;CHO细胞在Tubespin中的培养工艺及其代谢分析[D];暨南大学;2011年
10 蔡明琰;人类白细胞抗原-G蛋白表达与肝细胞癌预后的关系[D];复旦大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 思;复旦大学社系列精品塑造一流出版品牌[N];中国图书商报;2005年
2 记者 张新合;市委书记张智全在复旦大学中国地市党政干部论坛发表演讲[N];陇东报;2008年
3 记者 徐瑞哲;杨玉良任复旦大学校长[N];解放日报;2009年
4 苏诗苗 李远明;复旦大学访问团到我市考察[N];三明日报;2009年
5 记者 潘荣进;复旦大学党委书记考察医药城[N];泰州日报;2010年
6 董秀晴 芮伟芬;市疾控中心与复旦大学 共建教科研基地[N];常州日报;2010年
7 吴澧 旅美学者;假如小孙进了复旦[N];南方周末;2010年
8 孙国根;复旦大学首倡“物联网医学”[N];中国医药报;2010年
9 本报记者 张滢莹;复旦大学创意写作班开学[N];文学报;2010年
10 顾雷鸣;复旦大学无锡研究院成立[N];新华日报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978