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脑型钠尿肽对神经系统细胞膜钾离子通道的调控和机制研究

费晓玮  
【摘要】: 钠尿肽家族是一个多肽类激素家族。该多肽以及其受体在生理和病理生理方面有着重要意义,涉及到肾脏系统、心血管系统、内分泌系统、神经系统和免疫系统等方面的调控,维持机体循环系统和内环境的稳定。众多的研究表明,钠尿肽可以调节许多离子通道。在神经系统中,钠尿肽作为一种神经肽,激活细胞膜上的受体蛋白从而引发多种生物效应。目前,有关脑型钠尿肽对神经系统离子通道的调控尚不清楚。我们选择神经系统两种细胞模型:Schwann细胞(胶质细胞)和小脑颗粒细胞(神经元),通过全细胞膜片钳记录,免疫组化和细胞增殖测试以及分子克隆技术,研究脑型钠尿肽(BNP)对这两种细胞模型上的延迟整流钾通道的调控机制,研究主要分以下三个部分: 第一部分:我们以取自小鼠坐骨神经和臂丛神经周围的Schwann细胞为胶质细胞模型,研究BNP对细胞膜钾电流以及细胞增殖的调制。通过全细胞膜片钳记录,我们发现BNP可增加Schwann细胞膜上TEA敏感的,I_K(延迟外向整流钾电流);在浓度为1 nM~500 nM范围内,这种增大作用具有部分浓度依赖性。同时,在100 nM BNP的作用下,I_K的半激活电位和半失活电位均发生左移。通过半定量PCR以及免疫组化鉴定,发现Schwann细胞表达A受体、B受体和C受体三种NP受体。先前的研究已表明BNP可与A受体和C受体结合,因此,我们使用NPR-A阻断剂和激动剂进行了涉及受体亚型的鉴定。实验结果揭示,给予200 nM anantin(NPR-A阻断剂)可抑制BNP的作用,而50 nM cANF(NPR-C特异性激动剂)无法模拟BNP的作用,提示BNP对于I_K的作用是通过NPR-A这一途径,而非NPR-C途径。细胞外给予50 gM 8-Br-cGMP可模拟BNP对I_K的增大作用,而细胞外给予100 gM db-cAMP则不能产生类似于BNP的效应。这些结果进一步提示BNP是通过A受体激动下游的cGMP通路,进而激活I_K。另外,我们将Schwann细胞在含有BNP的培养液中孵育五天,随后通过增殖检测和S100蛋白免疫组化标记,发现经BNP处理的Schwann细胞增殖能力有所增强。综上所述,神经肽BNP可增人Schwann细胞的I_K并对细胞增殖有一定的促进作用。BNP对于细胞增殖的促进作用,是否有钾通道这一途径的参与,还需进一步研究证实。这些研究有助于我们了解神经肽对于神经系统各层面的调控,以及胶质细胞自身的调控机制,并将这些研究应用于神经损伤治疗。 第二部分:我们在大鼠小脑颗粒细胞上研究BNP对细胞膜钾电流的调制。通过免疫组化鉴定,我们发现颗粒细胞上表达三种钠尿肽受体。通过全细胞膜片钳记录,我们发现BNP可减小颗粒细胞上TEA敏感的I_K;在浓度为10nM~1000nM范围内,这种增大作用具有部分浓度依赖性。同时,BNP可使小脑颗粒细胞I_K的半失活电位发生左移。给予200 nM anantin可抑制BNP的作用,而50 nM cANF无法模拟BNP的作用,提示BNP对于I_K的作用是通过NPR-A这一途径,而非NPR-C途径。细胞外给予50μM 8-Br-cGMP可模拟BNP对I_K的增大作用。这些结果进一步提示BNP通过A受体激动下游的cGMP通路降低I_K。BNP对颗粒细胞上钾电流的下调,可能参与调控神经细胞的兴奋性,以及与细胞的保护机制相关。 第三部分:BNP对Schwann细胞和小脑颗粒细胞上的延迟整流钾通道的调控途径相似,但是调控结果相反,可能是由于被调控的亚单位不同造成的。神经细胞中I_K的主要亚单位是Kv2.1α亚单位。我们使用Kv2.1α亚单位的特异性阻断剂JZTX-Ⅲ。1μM JZTX-Ⅲ存在时,BNP在颗粒细胞上对电流的抑制效果消失,电流幅度为原本的93.40±3.27%。而此时,BNP在Schwann细胞上对电流的增大效应依旧存在,增大46.24±1.45%,和Kv2.1α亚单位未被抑制时的电流增大率46.73±7.26%相比,无显著性差异。在颗粒细胞上BNP似乎仅对Kv2.1α亚单位有调控作用,而在Schwann细胞上Kv2.1α亚单位是BNP调控的一个对象之一。在转染了pmCherry-Kv2.1的HEK293细胞上,BNP无法调控Kv2.1α亚单位幅度,但可以调控通道的失活特性,这一调控与在颗粒细胞上表现一致。从Schwann细胞上克隆得到Kv1.2和Kv1.5α亚单位,转染到HEK293细胞上。结果发现BNP可上调Kv1.2α亚单位的幅度,下调Kv1.5α亚单位的幅度,并调控Kv1.2α亚单位的动力学特性。


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