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ERT对手术绝经妇女T淋巴细胞凋亡的影响及ER作用的分子机制

张婧  
【摘要】: 研究背景 近年的不少研究提示雌激素在机体免疫功能和免疫介导性疾病中起重要作用,其机制可能和雌激素受体有关。妇女绝经后体内女性激素急剧下降,其免疫功能也发生了很大变化。随着雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy,ERT)的广泛应用,其对绝经后妇女免疫功能的影响也受到人们的关注。但关于ERT对绝经妇女免疫细胞凋亡影响的研究还很少,对其机制也尚不十分明确。 第一部分经皮ERT对手术绝经妇女T淋巴细胞凋亡及ER亚型表达的影响 目的 研究手术绝经妇女T淋巴细胞凋亡、ER亚型表达的变化以及经皮雌二醇凝胶对手术绝经妇女绝经期症状的临床疗效以及对T细胞凋亡、ER亚型表达的影响。 方法 选取手术绝经1~5年以内的妇女15名,同时选取自然绝经妇女和生育年龄妇女各15名作为对照组,抽取外周静脉血,全自动微粒子化学发光免疫分析系统(ACCESS)检测静脉血中E_2和FSH水平,并分离出T淋巴细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,Westernblot方法检测T细胞上凋亡基因Fas、FasL以及ER亚型α、β的表达。手术绝经组共有13人接受了经皮ERT,使用经皮雌二醇凝胶治疗3个月,用药前后采用“改良Kupperman评分法”和“绝经期生存质量量表”评估围绝经症状和生存质量的情况,用药后再次检测静脉血中E_2和FSH水平、T淋巴细胞凋亡率、Fas、FasL、ERα、ERβ蛋白表达,与用药前进行比较。 结果 1、手术绝经和自然绝经妇女的血清E_2水平显著低于生育年龄组,FSH水平显著高于生育年龄组(P<0.01);T淋巴细胞凋亡率显著高于生育年龄组(P<0.05)。 2、手术绝经和自然绝经妇女外周血T淋巴细胞上凋亡基因Fas、FasL的蛋白水平显著高于生育年龄组(P<0.05);ERα、ERβ的蛋白水平显著低于生育年龄组(P<0.05或P<0.01)。 3、手术绝经组用经皮雌二醇凝胶治疗三个月后,血清E2水平较用药前有显著升高(P<0.05),FSH水平较用药前有下降趋势,但差异无显著性。 4、手术绝经组用经皮雌二醇凝胶治疗三个月后,T淋巴细胞凋亡率以及FasL蛋白水平较用药前有所下降,但未达统计学差异。 5、手术绝经组用经皮雌二醇凝胶治疗三个月后,T淋巴细胞上ERα、ERβ蛋白水平均较用药前有显著升高(分别为P<0.05、P<0.01)。 6、手术绝经组用经皮雌二醇凝胶治疗三个月后,改良Kupperman评分和绝经期生存质量量表评分较用药前均有显著下降(P<0.01);活化部分凝血酶时间较用药前有显著升高(P<0.05);甘油三酯、低密度脂蛋白水平较用药前有显著降低(P<0.05)。 结论 1、妇女绝经后,激素水平改变,T淋巴细胞凋亡率、Fas、FasL表达水平显著增加,ERα、ERβ水平显著下降。T淋巴细胞凋亡增加与围绝经期症状以及机体衰老可能有关。 2、经皮ERT显著升高了手术绝经妇女血清E_2水平及T淋巴细胞上ERα、ERβ的蛋白水平,其中ERβ的上调水平更为明显。 3、经皮ERT对手术绝经妇女T淋巴细胞凋亡及FasL的蛋白水平有降低的趋势,但差异未达到统计学意义。提示低剂量ERT对免疫功能可能有保护作用。 4、经皮雌二醇凝胶显著改善了手术绝经妇女的围绝经期症状和生存质量,且对凝血功能和脂代谢也有一定的改善。 第二部分不同浓度雌二醇对去势小鼠T淋巴细胞凋亡的影响及其受体作用机制 目的 研究不同浓度雌二醇(estradiol,E_2)对去势小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡和雌激素受体亚型表达的影响并探讨其作用机制。 方法 分离出8周龄雌性Balb/c小鼠脾脏T淋巴细胞,分为10组:青年组、假手术组、去势空白组、去势+E_2(10~(-11)M、10~(-10)M、10~(-8)M、10~(-6)M)组、去势+E_2(10~(-10)M)+ICI182,780(10~(-7)M)组、去势+E_2(10~(-10)M)+MPP(10~(-6)M)组、去势+E_2(10~(-10)M)+PDTC(10~(-5)M)组。培养72小时后收集细胞,Annexin V/PI双染色流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Westernblot方法检测各组细胞ERα、ERβ、Bax、Bcl-2蛋白表达及细胞核中NF-κB主要亚基P65的蛋白水平。 结果 1、去势空白组凋亡率高于青年组和假手术组(P<0.01),而Bcl-2、核内P65蛋白水平均低于青年组和假手术组(P<0.01); 2、去势+E_2 10~(-10)M组凋亡率低于去势空白组(P<0.05),Bcl-2及核内P65蛋白水平高于去势空白组(P<0.01);而去势+E_2 10~(-8)M、10~(-6)M组凋亡率均高于去势空白组(分别为P<0.05,P<0.01); 3、去势空白组ERα、ERβ蛋白水平均低于青年组和假手术组,去势+E_2 10~(-11)M、10~(-10)M、10~(-8)M组ERα、ERβ蛋白水平均高于去势空白组,而去势+E_2 10~(-6)M组低于去势空白组(均为P<0.01); 4、去势+E_2(10~(-10)M)+ICI182,780组及去势+E_2(10~(-10)M)+PDTC组凋亡率与去势空白组无显著差异,去势+E_2(10~(-10)M)+MPP组凋亡率与去势+E_210~(-10)M组无显著差异。 结论 1、小鼠去势后T淋巴细胞凋亡增多,抑制凋亡基因bcl-2以及转录因子NF-κB的活性降低;ERα、ERβ的水平也降低。 2、E_2对去势小鼠T淋巴细胞的凋亡呈剂量依赖的双相调节作用:生理范围内可部分逆转去势小鼠T淋巴细胞凋亡,而超过生理范围则进一步增加其凋亡。 3、生理剂量E_2可能通过ERβ及NFκB途径抑制去势小鼠的T淋巴细胞凋亡。 第三部分雌二醇调节人T淋巴细胞系Jurkat细胞凋亡的分子机制 目的 研究E_2调节人T淋巴细胞凋亡的可能的分子作用机制。 方法 将处于对数生长期的Jurkat细胞接种于培养板,加入不同浓度的E2及阻断剂,分别处理24、48小时,分为9组:空白对照组、E_210~(-10)M处理24小时组、E_210~(-8)M处理24小时组、E_210~(-6)M处理24小时组、E_210~(-10)M处理48小时组、E_210~(-8)M处理48小时组、E_210~(-6)M处理48小时组、E_210~(-8)M+ICI182,780(10~(-7)M)处理48小时组、E_210~(-8)SM+MPP(10~(-6)M)处理48小时组。Annexin V/PI双染色流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Westernblot方法检测各组细胞ERα、ERβ、Fas、FasL蛋白水平及细胞核中NF-κB主要亚基P65的蛋白水平。免疫共沉淀法检测细胞核中ERα、ERβ与NF-κB的相互作用。 结果 1、E_2处理组的Jurkat细胞凋亡率及凋亡基因Fas、FasL的蛋白表达均显著高于空白对照组,且E_2浓度越大、处理时间越长,凋亡率和凋亡蛋白的表达量越高。 2、Jurkat细胞上存在内源性的ERα、ERβ蛋白表达,E_2处理组这二者的表达量显著高于空白对照组,且E_2浓度越大,二者表达量越高。 3、E_2(10~(-8)M)加ICI182,780(10~(-7)M)处理48h的Jurkat细胞凋亡率显著低于只用E_2(10~(-8)M)处理组,与空白对照组无显著差异;E_2(10~(-8)M)加MPP(10~(-6)M)处理48h的Jurkat细胞凋亡率与只用E_2(10~(-8)M)处理组无显著差异,而显著高于空白对照组。 4、E_2+TNFα处理后细胞核中的P65蛋白水平显著高于单用TNFα处理组及空白对照组;E_2浓度越高、处理时间越长,核P65蛋白水平越高。 5、将P65多克隆抗体及ProteinA加入Jurkat细胞核蛋白中进行Co-IP,得到的沉淀物进行Westernblot同时检测出了P65和ERβ蛋白。 结论 1、E_2可增加Jurkat细胞的凋亡,并增加Fas、FasL的蛋白表达,且其作用与E_2的剂量和处理时间呈正相关。 2、Jurkat细胞上存在ERα、ERβ的表达,且E_2可上调这两种受体的表达,E_2剂量越大,ER表达量越高。 3、E_2可能通过ERβ发挥其促进Jurkat细胞凋亡的作用。 4、E_2能增加Jurkat细胞中NF-κB的转录活性,Jurkat细胞中NF-κB活性增加有促进凋亡的作用。ERβ与NF-κB在Jurkat细胞核中存在直接相互作用,E_2可能通过ERβ影响了NF-κB的转录活性,进一步影响了Jurkat细胞的命运。


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