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雌激素调节骨髓源性内皮祖细胞修复梗死心肌

李海清  
【摘要】: 心肌梗死是心力衰竭的主要原因。一些临床研究显示绝经前的心力衰竭女性预后比相应年龄的男性好。而且,多中心有关心力衰竭试验的回顾性分析表明,使用雌激素的绝经女性心力衰竭的预后比未使用雌激素的绝经女性预后好,这些都提示雌激素对心血管系统具有保护作用。但随机临床试验显示雌激素会增加发生不良心血管事件的风险,使在绝经妇女中普遍使用雌激素替代治疗的方案受到质疑。然而,动物实验研究和流行病学研究强烈提示雌激素对心血管系统有益,使得雌激素对心血管系统的有益作用研究开始转向新的可能机制和途径,即近十年来始终是研究的热点之一:内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。 EPCs修复梗死心脏主要是通过促进心肌梗死部位新生血管形成,增加血流灌注,促进组织再生,限制梗死部位疤痕发展,延缓心室重塑,从而改善心功能。在冠心病和有患冠心病危险因素的患者,EPCs的数量及其迁移、增殖、归巢及血管新生等功能明显降低。因此,在EPCs移植治疗心肌梗死过程中,如何提高EPCs的归巢及其血管新生功能成为当前研究的焦点。 基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)与其唯一受体CXCR4构成的SDF-1α/CXCR4轴在EPCs归巢及新生血管形成过程中起着重要作用。有关雌激素是否可通过作用于SDF-1α/CXCR4轴调节EPCs的归巢和血管新生功能及其作用机制,目前研究尚少。由于全身应用雌激素副作用大,且作用的组织细胞广泛,难以阐述清楚雌激素的具体作用机制。因此,本实验首先通过建立卵巢切除模型,初步研究生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞(bonemarrow-derived endothelial progenitor cells,BM-EPCs)在体外向SDF-1α迁移和血管新生功能的影响及作用机制;然后在体外进一步研究雌激素预处理对BM-EPCs迁移和血管新生功能的影响及其作用机制;最后研究雌激素预处理BM-EPCs对其在移植治疗心肌梗死中体内归巢的影响,并研究雌激素预处理BM-EPCs在移植治疗心肌梗死中的作用及其机制。 第一部分生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞迁移及血管新生功能的影响 [目的]研究生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞(BM-EPCs)迁移及血管新生功能的影响及其机制。 [方法]6周龄雌性BALB/C小鼠随机分成卵巢切除组、假手术组和正常组。分别于1周和4周后,ELISA法检测各组小鼠血清雌激素浓度。4周后,取胫骨和股骨骨髓,培养、鉴定BM-EPCs。Transwell小室检测各组BM-EPCs经或未经CXCR4抑制剂AMD3100处理后向基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的迁移功能。血管生成试验检测各组BM-EPCs经或未经CXCR4抑制剂AMD3100处理后形成管样物的长度。RT-PCR、流式细胞术和Western blot检测各组BM-EPCs CXCR4的表达。 [结果]卵巢切除1周和4周后,卵巢切除组小鼠血清雌激素浓度(23.09±4.01pmol/L)(20.75±2.75 pmol/L)均明显低于假手术组(894.53±71.98 pmol/L)(910.18±58.77 pmol/L)(P<0.01)和正常组(867.52±77.08 pmol/L)(901.66±78.57pmol/L)(P<0.01),而假手术组和正常组无显著差异(P>0.05)。卵巢切除组BM-EPCs向SDF-1α迁移的数量(102.67±7.02/400倍视野)明显低于假手术组(172.00±9.17/400倍视野)(P<0.01)和正常组(174.67±10.41/400倍视野)(P<0.01),而假手术组和正常组无明显差异(P>0.05)。经CXCR4抑制剂AMD3100处理后,卵巢切除组、假手术组和正常组向SDF-1α迁移的数量均明显减少(55.33±5.51/400倍视野vs 102.67±7.02/400倍视野)(57.00±4.58/400倍视野vs172.00±9.17/400倍视野)(60.00±5.00/400倍视野vs 174.67±10.41/400倍视野)(P<0.01),但组间比较没有显著差异(P>0.05)。卵巢切除组BM-EPCs形成管样物的长度(5386±405μm/50倍视野)明显低于假手术组(7768±466μm/50倍视野)(P<0.01)和正常组(7514±547μm/50倍视野)(P<0.01),而假手术组和正常组无显著差异(P>0.05)。正常组BM-EPCs经CXCR4抑制剂AMD3100处理后,形成管样物的长度明显降低(3292±310μm/50倍视野vs 7514±547μm/50倍视野)(P<0.01)。卵巢切除组BM-EPCs CXCR4的表达明显低于假手术组和正常组(P<0.01),而假手术组和正常组无显著差异(P>0.05)。 [结论]生理性雌激素通过调节BM-EPCs功能性CXCR4的表达而增强其迁移及血管新生功能。 第二部分雌激素预处理提高骨髓源性内皮祖细胞迁移及血管新生功能的体外实验研究 [目的]研究体外雌激素预处理对骨髓源性内皮祖细胞(BM-EPCs)迁移及血管新生功能的影响及其机制。 [方法]6周龄雌性BALB/C小鼠卵巢切除4周后,取胫骨和股骨骨髓,培养、鉴定BM-EPCs。分别采用0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L 17β-雌二醇或相应浓度17β-雌二醇和雌激素受体拮抗剂ICI182 780与BM-EPCs共培养。48小时后,Transwell小室检测各组BM-EPCs经或未经CXCR4抑制剂AMD3100处理后向基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的迁移功能。血管生成试验检测BM-EPCs经或未经AMD3100处理后形成管样物的长度。RT-PCR、流式细胞术和Western blot检测各组BM-EPCs CXCR4的表达。 [结果]17β-雌二醇呈剂量依赖性增强BM-EPCs的迁移及CXCR4的表达(P<0.05),但被雌激素受体拮抗剂ICl182 780完全阻断(P>0.05)。同样,17β-雌二醇明显增强BM-EPCs的血管新生功能(P<0.05),但被雌激素受体拮抗剂ICI182780完全阻断(P>0.05)。经CXCR4抑制剂AMD3100处理后,17β-雌二醇预处理的BM-EPCs的迁移和血管新生功能均明显受损(P<0.05)。 [结论]雌激素通过雌激素受体途径上调BM-EPCs功能性CXCR4的表达而增强其迁移及血管新生功能。 第三部分雌激素预处理骨髓源性内皮祖细胞提高细胞移植治疗急性心肌梗死疗效的体内实验研究 [目的]研究雌激素预处理骨髓源性内皮祖细胞(BM-EPCs)对其体内归巢及治疗急性心肌梗死疗效的影响。 [方法]6周龄雌性BALB/C小鼠切除卵巢4周后,结扎前降支建立心肌梗死模型,RT-PCR及免疫组化检测心肌梗死前和心肌梗死后1d、3d、7d、14d、21d心肌梗死区基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的表达。心肌梗死后3d小鼠分成3组,分别经尾静脉注射经17β-雌二醇预处理的BM-EPCs、未经17β-雌二醇预处理的BM-EPCs和生理盐水作为空白对照。BM-EPCs移植后4d、11d,MRI实时示踪和普鲁士蓝染色分析心肌梗死区BM-EPCs的归巢量。BM-EPCs移植后25d,超声心动图检测3组小鼠的左室收缩末内径(LVDs)、左室舒张末内径(LVDd)、缩短分数(FS)和射血分数(EF);免疫组化检测3组小鼠心肌梗死区新生血管密度;Masson染色检测3组小鼠左室纤维化面积与左室总面积的百分比。 [结果](1)心肌梗死后1d,SDF-1α表达即明显增高;在心肌梗死后3d达高峰;心肌梗死后7d仍维持在较高水平(P<0.01)。但在心肌梗死后14d、21d,SDF-1α表达明显降低,与正常心肌中SDF-1α表达水平无明显差异(P>0.05)。(2)BM-EPCs移植后4d、11d,17β-雌二醇预处理组心肌梗死区中归巢的BM-EPCs数量明显高于未经17β-雌二醇预处理组(P<0.05)。(3)BM-EPCs移植后25d,17β-雌二醇预处理组小鼠心室扩张程度明显轻于空白对照组(LVDs:3.09±0.05 vs3.27±0.10 mm,P<0.05:LVDd:4.18±0.07 vs 4.3±0.05 mm,P<0.05),未经17β-雌二醇预处理组小鼠心室扩张程度与空白对照组无明显差异(LVDs:3.18±0.07 vs 3.27±0.10 mm,P>0.05:LVDd:4.24±0.06 vs 4.31±0.05 mm,P>0.05)。17β-雌二醇预处理组小鼠的心功能也好于空白对照组(FS,%:33±3.8 vs26±3.2,P<0.05),未经17β-雌二醇预处理组小鼠的心功能与空白对照组无明显差异(FS,%:28±4.7 vs 26±3.2,P>0.05)。虽然17β-雌二醇预处理组和未经17β-雌二醇预处理组小鼠EF值分别比对照组增加了4.72%和3.29%,但3组小鼠的EF值无统计学差异(P>0.05)。(4)17β-雌二醇预处理BM-EPCs移植组心肌梗死区域新生血管密度明显高于对照组(1428±214/mm~2 vs 1070±168/mm~2,P<0.05),未经17β-雌二醇预处理BM-EPCs移植组心肌梗死区域新生血管密度与对照组无显著差异(1214±157/mm~2 vs 1070±168/mm~2,P>0.05)。(5)经17β-雌二醇预处理BM-EPCs移植组左室纤维化面积占整个左室面积的百分比明显低于对照组(8.8±4.9%vs 49.0±4.6%,P<0.05),而未经17β-雌二醇预处理组与对照组无显著差异(41.6±5.2%vs 49.0±4.6%,P>0.05)。 [结论](1)急性心肌梗死后1周内,心肌梗死区中SDF-1α表达水平处于较高水平,为BM-EPCs移植最佳时期。(2)雌激素预处理可增强BM-EPCs归巢,促进心肌梗死区新生血管形成,减轻心室重塑,从而改善心功能。


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