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转铁蛋白修饰的CPT-PAMAM-PEG复合物的肿瘤靶向研究

唐国涛  
【摘要】: 恶性肿瘤已经成为威胁人类健康和生命的最主要疾病之一,其发病率每年新增近1千万例。近几年对肿瘤生理深入的探索,促进了肿瘤诊断和治疗的发展,其死亡率有所下降。目前肿瘤的治疗手段包括手术治疗,放疗和化疗等,放化疗在杀死肿瘤细胞的同时也能杀死正常细胞,给病人带来严重的毒副作用。因此研制更有效地靶向肿瘤细胞的给药系统显得尤为迫切。被动靶向释药系统成功利用肿瘤的生理特征使载药系统通过EPR效应在肿瘤部位蓄积。药物聚合物纳米载体系统由于其良好的可调控性、易于表面修饰、较高的药物包封率、较强的药物保护作用和适于大规模生产,已成为研究热点之一。虽然被动靶向释药奠定了靶向给药临床治疗的基础,但仍存在难以克服一些问题,如并不是所有的肿瘤都能体现出EPR效应,肿瘤细胞的多药耐药现象使部分药物不能有效地进入肿瘤细胞等等。要克服这些困难,则需要使载药系统主动地靶向肿瘤细胞,主动靶向可以通过与细胞表面特定的受体相结合的配体或抗体来实现。 本课题通过药剂学、高分子材料学、药理学、分子生物学等手段的交叉应用,以喜树碱(CPT)为模型药物,转铁蛋白(Tf)为靶向头基,首先制备载CPT的主动靶向隐形纳米载药系统,将聚乙二醇(PEG)修饰的被动靶向与Tf修饰的主动靶向作用相结合,有效递送药物到达肿瘤部位。 本课题以琥珀酸酐为连接剂,首先合成了琥珀酰喜树碱酯,并用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。用带有双功能基团的NHS-PEG-MAL分子上的NHS端与PAMAM上的氨基相连,合成了三种不同PEG化程度的PAMAM-PEG(PP_(16),PP_(32)和PP_(48)),通过~1H NMR计算PAMAM所连接的PEG数量并测定了粒径和Zeta电位。喜树碱琥珀酸活化酯与PAMAM表面剩余的氨基共价连接,合成了CPT-PAMAM-PEG纳米载药系统(CPP_(16),CPP_(32)和CPP_(48))。药物的体外释放显示出缓释的特性(120小时内累积释放75%)。用Traut's试剂将转铁蛋白巯基化,合成了转铁蛋白修饰的主动靶向载药纳米复合物CPT-PAMAM-PEG-Tf(CPP_(16)T,CPP_(32)T和CPP_(48)T),采用bradford法测得平均每个PAMAM复合物连接1分子转铁蛋白。连接转铁蛋白后复合物的粒径增加了近一倍,Zeta电位由正负。转铁蛋白修饰的CPT复合物较CPT原料药和未经转铁蛋白修饰的复合物对KB,K562和S180细胞显示出更强的抗肿瘤活性。细胞摄取实验显示转铁蛋白修饰的PAMAM-PEG复合物在KB、K562细胞中的摄取量分别为未经Tf修饰复合物的3.38~3.46倍和2.52~2.86倍。实验显示转铁蛋白修饰的PAMAM-PEG复合物在KB细胞中的摄取具有浓度依赖性,且转铁蛋白可以明显抑制复合物的摄取,说明其通过细胞表面高表达的转铁蛋白受体介导的内吞进入细胞。 以异硫氰酸罗丹明B(RBITC)为荧光标记物,合成了带荧光标记物的RPP和RPPT。采用各种内吞抑制剂对复合物的内吞机制进行了初步探讨,结果显示RPP_(48)和RPP_(48)T都是由细胞表面的网格蛋白介导内吞,RPP_(48)T以细胞表面的转铁蛋白受体介导的内吞为主。用Lysotracker green对细胞溶酶体进行染色,激光共聚集显微镜观察表明复合物内吞后经溶酶体途径转运。 采用Hochest和PI双染对低浓度CPT复合物诱导肿瘤细胞凋亡的研究发现,CPT,CPP_(48)和CPP_(48)T 12h诱导细胞早期凋亡率分别为0.76%,2.41%和4.63%,24h分别为4.75%,16.02%和30.91%。说明CPP_(48)T被肿瘤细胞摄取最多,诱导凋亡的效果最好。 大鼠体内药动学显示复合物中PEG化程度越大,复合物在体内的半衰期和平均滞留时间越长,AUC也越大,但是经转铁蛋白修饰的复合物较未经Tf修饰的复合物的半衰期短。S180荷瘤小鼠体内的组织分布结果表明CPP_(48)T给药后药物在肿瘤内的达峰浓度最高,分别是CPT和CPP_(48)的8.4和2.7倍,AUC分别是CPT和CPP_(48)的28.7和3.6倍。CPP_(48)T的相对靶向效率最高(28.7),显示CPP_(48)T的肿瘤靶向性最强。 对S-180荷瘤小鼠的药效研究结果表明,CPP_(48)T具有最强的抗肿瘤活性,其肿瘤抑制率为65.7%,分别是CPT和CPP_(48)的1.81和1.27倍,显出主动靶向与被动靶向相合的优势。荷瘤小鼠的体重变化和小鼠小肠的组织病理切片显示其没有明显的毒副作用。肿瘤组织切片免疫组化结果显示,CPP_(48)T肿瘤细胞增殖最少,细胞凋亡最明显,表明CPP_(48)T具有最强的抗肿瘤活性。


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