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肥大细胞膜机械敏感性离子通道的研究

汪丽娜  
【摘要】: 目的: 研究人肥大细胞系(HMC-1)机械敏感性离子通道的电学特性;建立适用于膜片钳记录的外周组织片模型,并进一步对其中原位肥大细胞(mast cell,MC)的机械敏感性进行验证。 方法: (1)在光镜显微镜下观察低渗环境导致HMC-1细胞处于高应力状态中对该细胞脱颗粒的影响。 (2)利用荧光成像技术,以钙绿(Calcium Green-1 AM)为荧光指示剂,测量低渗环境中HMC-1胞内Ca~(2+)浓度_i)的变化。 (3)在膜片钳外面朝外(outside-out)和细胞吸附(cell-attached)两种模式下,通过膜片钳记录电极对细胞膜施加正压(+30~+60 cmH_2O)或负压(-60~-30 cm H_2O)刺激,测量和分析HMC-1上张力激活性(stretch-activated,SA)离子通道的单通道特性。 (4)制备大鼠“后三里”穴区(ST36)皮下结缔组织片,用甲苯胺蓝(Toluidineblue,TB)或中兴红(Neutral red,NR)染色观察组织片内MCs的分布,并用膜片钳全细胞(whole-cell)模式对组织片内原位MCs的SA电流进行记录。 结果: (1)在230 mOsm/kg的低渗细胞外液中,处于稳定状态的HMC-1细胞会在5~30分钟内出现脱颗粒现象,脱颗粒率为54.9±8.5%(n=4个独立实验,P≤0.01)(mean±SEM)。低渗环境导致HMC-1脱颗粒效应可被Cl~-通道阻断剂DIDS和香草精受体TRPV2阻断剂SKF96365抑制,脱颗粒率分别下降到17.7±5.4%(n=4个独立实验,P≤0.05)和22.2±7.9%(n=2个独立实验)。 (2) 250 mOsm/kg的低渗细胞外液能增加HMC-1胞内相对钙荧光强度,荧光强度从对照组的100%上升到116.7±3.6%(n=52,5个独立实验,P≤0.01)。TRPV蛋白阻断剂钌红(ruthenium red,RuR)、SKF96365和DIDS能取消或抑制该增强效应,胞内相对钙荧光强度分别下降到100.3±0.9%(n=41,3个独立实验,P≤0.01)、103.7±3.2%(n=30,3个独立实验,P≤0.05)和67.8±5.2%(n=29,4个独立实验,P≤0.01)。 (3)在膜片钳实验中,直接的压力牵张可激活HMC-1细胞SA通道。SA单通道电流表现出较强的外向整流性。+100 mV膜电位下的通道电导为55.1±3.4 pS(n=38)。SA通道的开放概率(open probability,P_o)具有电压依赖性,在正膜电位下急剧增大;并且具有压力依赖性,P_o随着外界压力的增加而增大,在+20 mV膜电位下,达到最大P_o值一半所需的压力为26.4 cm H_2O。在+60mV膜电位下,通道开放时间分布(open-time distribution)能被3个指数函数拟合,时间常数分别为τ_(1o)=755.1 ms、τ_(2o)=166.4 ms和τ_(3o)=16.5 ms;通道关闭时间分布(closed-time distribution)也能被3个指数函数拟合,时间常数分别为τ_(1c)=661.6 ms、τ_(2c)=253.2 ms和τ_(3c)=5.6 ms。 (4) HMC-1细胞的SA单通道活动具有细胞外Cl~-浓度([Cl~-]_o)依赖性(n=9)。当[Cl~-]_o由169 mM降低到19 mM后,+100mV膜电位下的电导从44.2±4.4 pS下降到15.1±1.6 pS(P≤0.01)。在+60 mV膜电位下,P_o降低到对照组的62.2±13.6%(P≤0.01)。V_(1/2)从5.5±2.7mV上升到45.6±6.9 mV。 (5) HMC-1细胞SA单通道活动可被Cl~-通道阻断剂DIDS可逆性抑制(n=9)。+100 mV膜电位下的电导从58.5±4.1 pS下降到18.9±7.0 pS(P≤0.01)。+60 mV膜电位下,P_o降低到对照组的20.6±1.4%(P≤0.01)。 (6)用细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)断裂细胞骨架后发现,激活SA通道所需的压力降低。 (7)大量MCs分布在大鼠“后三里”穴区(ST36)的皮下结缔组织片内。和HMC-1类似,大鼠原位MCs也同样表达机械敏感性离子通道。SA通道的全细胞电流表现出外向整流性,并随外界压力的增加而增大。+100 mV膜电位下,由-60 cm H_2O激活的SA通道的电导为83.2±25.5 pS,翻转电位约为-35.8 mV。 结论: HMC-1脱颗粒效应可被机械刺激激活,DIDS敏感性Cl~-通道和TRPV2蛋白参与HMC-1机械敏感性机制,并且[Ca~(2+)]_i增加可能是该机制中重要的信号途径之一。这种机械敏感性在大鼠原位MCs上也进一步得到了证实。


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