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绿脓杆菌制剂对乳腺癌细胞生物学特性的影响及机制研究

刘哲斌  
【摘要】: 目的 检测绿脓杆菌制剂(PA-MSHA, Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin)对人乳腺癌细胞的生物学特性包括抗增殖、诱导凋亡特性等的影响,并深入探讨其作用靶点以及体内体外实验中对人乳腺癌细胞的作用机制。 方法 第一部分 1、光学显微镜观察PA-MSHA作用后细胞形态变化。 2、WST (water-soluble tetrazolium salt)法测定PA-MSHA以及PA对人乳腺癌细胞或正常乳腺上皮细胞体外增殖的影响,并绘制细胞增殖曲线。 3、标准PI染色流式细胞计数法(flow cytometry, FCM)检测PA-MSHA对人乳腺癌细胞细胞周期分布的影响。 4、Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法检测PA-MSHA对人乳腺癌细胞凋亡的影响。 5、Hoechst33258染色检测PA-MSHA作用后乳腺癌细胞核凋亡形态的变化。 6、透射电镜观察PA-MSHA作用后乳腺癌细胞形态的变化。 7、Western blot法检测PA-MSHA或PA作用后凋亡相关级联蛋白水平的变化。 第二部分 1、采用甘露糖或葡萄糖作用PA-MSHA共培育试剂,与PA-MSHA或PA共同作用于乳腺癌细胞,作为竞争性作用试剂,来检测其对PA-MSHA作用效应的影响。主要采用WST法、Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法、Hoechst33258染色、扫描电镜、western blot等方法检测甘露糖共培育对PA-MSHA引起的抗增殖、细胞凋亡、细胞周期阻滞等的影响。 2、通过Western blot检测PA-MSHA作用于乳腺癌细胞后EGFR通路下游主要分子总EGFR、磷酸化EGFR、总Akt、磷酸化Akt、总ERK和磷酸化ERK的表达水平。 3、设计并合成针对人EGFR基因的RNA干扰片段,将siRNA片段瞬转入乳腺癌细胞中,Western blot法验证片段下调EGFR表达的有效性。主要观察EGFR下调后PA-MSHA对EGFR下游通路蛋白表达水平以及细胞增殖水平的影响,以验证EGFR是否为PA-MSHA作用靶点。 4、通过Western blot以及ELISA方法检测PA-MSHA作用于乳腺癌细胞后侵袭转移相关基因表达的影响。 5、裸鼠乳房脂肪垫(mammary fat pad, MFP)接种人乳腺癌细胞,探讨PA-MSHA对裸鼠原位肿瘤生长及肺转移的影响。 结果 第一部分 1、乳腺癌细胞株MDA-MB-21HM以及MDA-MB-468细胞体外培养,PA-MSHA对乳腺癌细胞有直接杀伤作用,且有剂量依赖性以及时间依赖性,而对MCF-7细胞以及正常乳腺上皮MCF-10A相对耐药。而PA对乳腺癌细胞没有明显的杀伤作用。 2、PA-MSHA在体外能引起Go-G1期的细胞比例增高,而S期细胞比例显著降低。 3、PA-MSHA作用后能使乳腺癌细胞呈现出大量的圆形漂浮凋亡细胞形态,产生大量的吞噬体以及自噬体样空泡,体现为凋亡表现形态;细胞胞核呈现典型的凋亡细胞形态特征。 4、PA-MSHA作用于乳腺癌细胞后凋亡细胞的比率显著升高。 5、PA-MSHA对乳腺癌细胞有杀伤作用以凋亡为主,并依赖于caspase通路,可以看到caspase3、8、9活性片段表达增强,而PA没有该作用。 第二部分 1、扫描电镜发现PA-MSHA能粘附于乳腺癌细胞表面,并表现为皱缩、凋亡的细胞形态,在甘露糖作为竞争性抑制剂后,PA-MSHA无法粘附于细胞表面。 2、经甘露糖共培育后,PA-MSHA对MDA-MB-231HM以及MDA-MB-468细胞相对耐药,其IC50值显著高于第一部分结果中所示的敏感细胞的IC50值;甘露糖共培育后,PA-MSHA的细胞周期阻滞作用以及诱导凋亡细胞作用均被抑制,caspase凋亡相关蛋白没有明显的活化。 3、PA-MSHA在体外能显著降低EGFR通路活性,AKT以及ERK的磷酸化水平均有明显下降。 4、下调EGFR表达后,PA-MSHA对EGFR下游通路蛋白的下调作用受到抑制。 5、下调EGFR表达后,PA-MSHA对细胞的诱导凋亡作用受到抑制,细胞死亡数目减少,存活率增高。 6、在甘露糖拮抗后,PA-MSHA对EGFR通路的抑制作用变得不明显,即磷酸化的EGFR通路相关蛋白并没有显著下调,表现其甘露糖对其作用的抑制性。 7、PA-MSHA作用后细胞中的一些和促侵袭相关的蛋白表达水平下降,抑制侵袭相关蛋白表达水平上调。 8、在体内,PA-MSHA能明显抑制乳腺癌裸鼠移植瘤肺转移,其机制可能与PA-MSHA在多环节促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成以及下调乳腺癌转移相关基因有关。 结论 1、PA-MSHA在体外可明显抑制乳腺癌细胞的生长,作用机制可能是通过抑制EGFR通路、死亡受体和线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡,并通过细胞表面甘露糖介导。 2、PA-MSHA能明显抑制乳腺癌裸鼠移植瘤肺转移,其机制可能与PA-MSHA在多环节促进肿瘤细胞凋亡、抑制生长因子受体途径、抑制肿瘤血管形成以及下调乳腺癌转移相关基因等有关。 3、PA-MSHA有可能成为具有自主知识产权的抗癌新药。PA-MSHA具有细胞毒和抑制肿瘤血管生成的双重作用,而且具有显著的抗转移作用,预示其在临床上有广阔的应用前景。


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