上皮性卵巢癌侧群细胞分离、鉴定及其在肿瘤形成过程中的作用研究

【摘要】： 上皮性卵巢癌侧群细胞分离、鉴定及其在肿瘤形成过程中的作用研究 目的：将上皮性卵巢癌细胞以Hoechst 33342染色后进行流式细胞仪检测,探讨卵巢癌侧群(SP)细胞的分离方法、干细胞特性和裸鼠体内致瘤能力,研究卵巢癌SP细胞在肿瘤形成过程中的作用。并通过慢病毒将GFP基因转入卵巢癌细胞中,分选GFP-SP细胞后以GFP作为示踪标记,追踪GFP-SP细胞在裸鼠体内的荧光表达和肿瘤成像检测。 材料和方法：1.选用人卵巢癌细胞株ES-2、HO-8910PM、HO-8910、SK-OV-3和CAOV-3细胞作为研究对象,取对数生长期细胞制成单细胞悬液,以Hoechst 33342染色,以流式细胞仪检测细胞拒染Hoechst 33342的比例。Verapamil作用下的Hoechst 33342拒染率作为对照。2.分选拒染Hoechst 33342的侧群(SP)细胞和NSP细胞,以单克隆抗体检测SP细胞、NSP细胞和未分选细胞表面CD24、CD44、CD45、CD54、CD62L、CDll7、CD133等表面标记的表达。3.收集SP细胞、NSP细胞和未分选细胞,以TRIZOL裂解液分离提取RNA,以RT-PCR法检测Nanog、Oct-4和BCRP等多能基因的表达,并以软琼脂半固体培养法和裸鼠皮下注射体内成瘤比较SP、NSP细胞的集落形成和致瘤能力。4.通过对细胞Transwell跨微孔膜迁移、穿透Matrigel以及贴壁能力的比较,了解SP细胞、NSP细胞在肿瘤侵袭能力方面的差异,并以人类全基因芯片分析SP细胞和NSP细胞在细胞黏附、侵袭方面的基因表达的不同,探究SP细胞和NSP细胞在肿瘤发生、转移中的作用。5.以慢病毒转染GFP至人卵巢癌细胞株ES-2、HO-8910PM,摸索Ubiquitin启动子构建的慢病毒颗粒对该2株细胞的最佳转移MOI。6.以流式细胞仪分选表达GFP的卵巢癌细胞株,获得高纯度的GFP-ES2和GFP-H08910PM,检测GFP表达对Hoechst 33342染色的影响。再以流式细胞仪分选GFP-SP细胞,将分选后GFP-SP细胞注射入裸鼠皮下,观察GFP-SP细胞的的致瘤能力,并在体观测GFP-SP来源肿瘤的荧光成像。 结果：1.卵巢癌细胞株中有一群能将Hoechst 33342泵出细胞外而不被Hoechst33342染色的细胞,Verapamil能降低细胞拒染Hoechst 33342的能力,这群细胞即为侧群细胞。2.SP细胞的比例和细胞BCRP的表达水平有关。ES-2/SP细胞表达Nanog、Oct-4等多能性基因,软琼脂中形成集落的数量比NSP细胞多。3.SP细胞体外贴壁培养时多呈簇状或集落性生长,细胞呈现鹅卵石或圆形；形成的集落细胞排列比较致密,向集落外扩展迁移的能力低。NSP细胞体外贴壁培养时多散在分布,细胞呈梭形或长条形；形成的细胞团比较疏松,向集落外扩展迁移的能力强。4.SP细胞穿过微孔膜的活动度和侵袭力都弱于NSP细胞。5.人类全基因芯片分析发现p-整合素、ICAM-5、CAM-1、各型胶原、层连蛋白、纤连蛋白等多种黏附分子受体/配体在SP细胞中的表达低于NSP细胞,protocadherin 7和CXCR4的表达高于NSP细胞。6.SP细胞在体外培养一定时间后,有部分细胞转为NSP细胞,但细胞拒染Hoechst 33342的比例仍高于NSP细胞培养后的Hoechst 33342拒染率。7.经流式细胞仪分选的HO-8910PM/SP细胞直接植入裸鼠皮下,其成瘤能力强于NSP细胞。8.分选纯化ES-2／SP细胞直接植入裸鼠皮下不能形成肿瘤,但体外培养后却能成瘤,而且致瘤能力仍强于NSP细胞,说明SP细胞在培养过程中细胞的生物学特性发生了变化。9.Ubiquitin启动子构建的慢病毒转染不影响卵巢癌细胞拒染Hoechst33342的能力,分选的GFP-SP细胞仍能在裸鼠体内形成表达GFP的肿瘤,成瘤能力和未转染细胞相比没有显著变化,GFP阳性肿瘤在成像系统中可见荧光表达。 结论：1.卵巢癌细胞株中有拒染Hoechst33342的SP细胞,SP细胞表达多能性基因,具有干细胞特征。2.SP细胞和NSP细胞相比,集落形成能力高于NSP细胞,但黏附能力和侵袭能力比NSP细胞弱,说明在肿瘤生成过程中,SP细胞作为肿瘤干细胞决定了肿瘤的发生,NSP细胞则有助于肿瘤细胞在局部组织中的侵袭,肿瘤干细胞在不断的自我更新和向NSP转化的过程中完成在局部的积聚和浸润,最终导致肿瘤的形成。3.慢病毒转染并不影响卵巢癌SP细胞的成瘤活性,病毒转染和GFP标记可以作为研究某一特性基因在卵巢癌发生、发展中作用的工具以及肿瘤细胞在动物活体内生物学行为的示踪标记。