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肺炎支原体耐药性及耐药机制研究

刘杨  
【摘要】: 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)属于柔膜体纲支原体科支原体属,是有能力在体外不依靠活细胞生存、能够进行自我复制的最小微生物之一。研究表明肺炎支原体是引起社区获得性呼吸道感染的主要病原体之一,可引起支气管炎和非典型肺炎。 肺炎支原体生长缓慢、培养周期长、体外分离培养比较困难,国内开展相关研究的单位很少。但只有获得肺炎支原体临床株才能进一步明确其生物学特性,了解肺炎支原体对目前常用抗菌药物的敏感性情况,进行分子流行病学研究,并开展新抗菌药物对肺炎支原体的药效学评价工作。 本研究建立了肺炎支原体临床株的分离培养方法,并进行连续收集和保存,建立了菌种库。采用经改良的微量稀释法测定药物敏感性,对大环内酯类耐药株进行了耐药机制研究和同源性分析。将Cycleave PCR技术应用于肺炎支原体及其耐药性的快速检测。同时对肺炎支原体感染患儿的临床疗效进行了回顾性研究。 本部分研究建立了从临床标本中分离培养肺炎支原体的方法,分离的临床菌株均良好保存。痰液标本来自2005年11月-2009年7月期间上海市儿童医院因呼吸道感染住院患儿的鼻咽部吸取物。分离培养标准流程为:①呼吸道标本直接接种于液体培养基;②37℃孵育观察颜色变化;③液体培养基≥4天变为清亮、无混浊的黄色;④取100μl加入1 ml SP4液体培养基中,37℃孵育;⑤隔日观察,约5-7天后可再次观察到液体培养基变为清亮的黄色;⑥重复上述④⑤步骤2-3次即可得到肺炎支原体纯种;⑦采用PCR方法进行筛选和菌种鉴定;⑧菌种保存于-70℃及液氮中各一份。经过近五年的分离培养、纯化和冻存工作,我们成功分离并保存了152株肺炎支原体临床分离株。临床儿童呼吸道送检标本中肺炎支原体培养总检出率约为4.8%(152/3159)。 目前仍没有被普遍接受的支原体药敏试验标准方法,结果判定也尚无国际统一标准。更多学者倾向于采用微量稀释法进行支原体药物敏感性测定。文献报道的方法是在微量孔内进行抗菌药物及培养基稀释。我们对微量稀释法进行改进,采用试管法先将抗菌药物对倍稀释后加样至微量板,与微量板孔内稀释相比可增加稀释的准确性。 本研究部分采用改良的微量稀释法测定了10种常用抗菌药物对肺炎支原体临床分离株的药物敏感性。结果显示,四环素类(四环素、多西环素、米诺环素)对肺炎支原体均具有良好的体外抗微生物活性。氟喹诺酮类中莫西沙星对肺炎支原体具有良好的体外抗微生物活性,MIC50和MIC90均为0.06 mg/L,明显优于环丙沙星和左氧氟沙星。肺炎支原体临床分离株对红霉素的敏感性低,MIC50和MIC90均128 mg/L。90.1%(137/152)临床分离株对红霉素耐药,所有137株耐药株中135株的红霉素MIC128 mg/L,2株红霉素MIC为64 mg/L。9.9%(15/152)的肺炎支原体临床株对红霉素敏感,MIC均≤0.015mg/L。肺炎支原体对阿奇霉素和克拉霉素的敏感性也明显下降,但阿奇霉素及克拉霉素的MIC值低于红霉素,阿奇霉素的MIC最高值为128 mg/L,无>128 mg/L的菌株。本研究中16环大环内酯类交沙霉素对肺炎支原体抗菌活性优于其他大环内酯类,MIC50和MIC90分别为4及8 mg/L。各年度肺炎支原体对红霉素的耐药率分别为,2005年60%(3/5),2006年82.4%(14/17),2007年100%(24/24),2008年80.8%(42/52),2009年100%(54/54)。 上述研究表明,肺炎支原体临床分离株对大环内酯类耐药率高,达90%以上。对于这些耐药菌是否存在克隆传播,需要进行分离株间的同源性分析以进一步明确。本部分研究分别采用经典的限制性片段长度多态性分析(RFLP)和多重位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法对肺炎支原体临床分离株进行分型。 152株肺炎支原体临床株除2株外均可以采用PCR-RFLP方法进行分型。92.0%(138/150)属于P1-Ⅰ型,8.0%(12/150)属于P1-Ⅱ型。Ⅰ型中红霉素敏感株占5.1%(7/138),耐药株94.9%(131/138);而Ⅱ型中敏感株占66.7%(8/12),耐药株占33.3%(4/12)。肺炎支原体PCR-RFLP I型的耐药率明显高于Ⅱ型(X2=119.47,P0.01)。采用MLVA分型方法,154株肺炎支原体(包括2株标准株)分为18种基因型(MT1-MT18),其中3个为独特类型仅含有一个菌株,其余15种基因型含有2或2株以上菌株,称为簇,最大的一簇含有21株肺炎支原体。簇内菌株在基因水平上存在亲缘性,具有同源性。MLVA(5位点)的分辨指数(HGI)为0.917,其中多态性较好位点的有VNTR1 (HGI 0.813, PI 0.777)和VNTR5 (HGI 0.454, PI 0.451),而其他位点分辨率较低。 以往研究显示,肺炎支原体对大环内酯类药物耐药主要与靶位改变有关,其耐药机制主要为核糖体23S rRNA V区中心环核苷酸序列改变导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药。A2063G突变是最常报道的突变位点,A2064G、A2063C等突变也有报道。 本部分对肺炎支原体临床分离株对大环内酯类的耐药机制进行了研究。自行设计引物对肺炎支原体核糖体23S rRNA全长进行扩增,产物测序。结果显示,137株红霉素耐药肺炎支原体临床株均存在23S rRNA的核苷酸点突变,其中A2063G突变135株,A2064G和A2064T突变各1株,其中A2064T点突变为首次发现。15株红霉素敏感株均不存在23S rRNA点突变。不同的核苷酸点突变所引起的大环内酯类耐药水平也有不同。A2063G所引起的耐药主要是针对14环和15环大环内酯类,而A2064G的点突变可引起16环大环内酯类的高水平耐药。与标准株Mp FH (ATCC 15531)相比,所有152株临床株均存在A1290G点突变,此点突变与耐药无关。 肺炎支原体分离培养困难、药敏试验周期长、采用PCR扩增测序进行耐药位点检测耗时,因此需要研发新的快速诊断方法,以期能够快速、同步检测肺炎支原体感染及耐药性。Cycleave PCR技术是一种由RNA和DNA构成的嵌合Cycling探针与RNase H组合使用的高灵敏度Real time PCR检测方法,是一个能检测出单个碱基突变的高特异性方法。 本部分研究采用Cycleave PCR技术建立了可检出肺炎支原体并鉴别其大环内酯类耐药突变株的方法,并成功应用于临床标本的检测。结果显示,CycleavePCR可检测出肺炎支原体并准确区分敏感野生株和突变耐药株,肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌基因组DNA等阴性对照均呈阴性,未出现假阳性结果。该方法检测带肺炎支原体23S rRNA基因片段重组质粒时的检测下限可达10拷贝/PCR反应。应用Cycleave PCR技术检测151株肺炎支原体临床分离株中,15株无突变敏感株、135株A2063G突变耐药株和1株A2064G突变耐药株分别出现了与阳性对照相同的扩增结果,与常规PCR扩增及测序结果完全相符。检测的150份痰液标本中,25份出现与阳性对照相同的扩增结果,其它125份均为阴性结果,也与常规PCR扩增及测序结果完全相符。 大环内酯类药物是治疗儿童肺炎支原体感染患者的首选药物。近年来肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药性呈上升趋势,是否仍然能够使用大环内酯类药物治疗耐药肺炎支原体感染成为临床医生关心的问题。日本学者采用回顾性研究方法指出大环内酯类耐药肺炎支原体感染的儿童患者的临床治疗反应较差。 本部分采用回顾性研究方法对阿奇霉素治疗大环内酯类敏感或耐药肺炎支原体感染患儿的临床疗效进行分析比较。共收集到上海市儿童医院2005年12月-2008年10月因呼吸道感染住院患儿病史57例,其中大环内酯类敏感肺炎支原体感染患儿共9例,大环内酯类耐药肺炎支原体感染患儿48例。所有48株耐药肺炎支原体的红霉素MIC均128 mg/L,均存在核糖体23S rRNA A2063G点突变。所有患儿均显示临床有效。针对57例患儿进行的统计分析结果显示,肺炎支原体对大环内酯类是否敏感与临床治疗反应密切相关,大环内酯类耐药肺炎支原体感染患儿的总住院时间、大环内酯类治疗后退热时间以及各阶段发热时间均较敏感株感染延长,其差异具有统计学意义。为了排除混合感染对疗效的影响,将合并有病毒或细菌检测阳性的病例剔除,对剩余38例患儿再次进行统计分析。为进一步消除不同联合用药的影响,对上述38例患儿再次进行筛选,选取21例联合使用相同抗感染治疗方案的患儿(均给予阿莫西林-克拉维酸联合阿奇霉素治疗)进行统计分析。不同分层分析的结果均显示,大环内酯类耐药肺炎支原体感染可引起总住院时间延长、阿奇霉素治疗后退热时间延长以及阿奇霉素治疗后38度以上持续时间延长,差异有统计学意义。


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