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MiRNA-126和miRNA-34a在胶质瘤细胞中功能的实验研究

栾世海  
【摘要】: 胶质瘤占中枢神经系统肿瘤的50%左右,即使经过广泛切除、放射治疗和化学治疗后,病变仍然具有局部侵袭性,容易复发。并且,高级别胶质瘤(间变型星形细胞瘤WHOⅢ;多形性胶质母细胞瘤WHOⅣ)患者的预后情况依然不佳。因此,临床上期待有更加行之有效的治疗方式。 MicroRNA (miRNA)是一类高度保守、长度很短的非编码调控单链RNA,约20 nt-24 nt,通过与目标mRNA互补配对导致mRNA降解或抑制转录后翻译诱导基因沉默。miRNA参与生命过程中一系列的重要进程,包括发育、造血、器官形成、细胞增殖和凋亡、癌症的发生、发展。目前,有大量证据表明:在胶质瘤中,miRNA异常表达参与了胶质瘤的肿瘤发生发展过程。例如在胶质瘤中,miRNA表达下调时,可能充当肿瘤抑制因子,如miR-128、miR-124、miR-137、miR-7、miR-125b、miR-15b;, miRNA表达下调时,可能充当原癌基因,如miR-21、miR-221-222。 本研究目的在于探讨miR-126和miR-34a对人胶质瘤细胞的抑制或杀伤作用,希望能够为今后该肿瘤基因治疗的临床研究和应用奠定坚实的基础。 1.根据既往研究的胶质瘤细胞系miRNA表达谱,在表达下调的miRNA中选择miR-126作为研究对象。应用实时定量RT-PCR验证miR-126在正常脑组织,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组织,及胶质瘤细胞系U251,A172,SHG-44细胞中的表达情况。在上述细胞系中,利用Lipofectamine2000传染miR-126或NC类似物后,应用MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期分布变化,Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡情况;应用Transwell小室体外侵袭和迁徙实验检测转染后细胞的体外侵袭和迁移能力改变。通过生物信息软件预测,结合体外靶基因3'-UTR荧光素酶报告基因活性检测,确定miR-126的靶基因Crk。通过实时定量RT-PCR和WB检测转染后Crk的mRNA和蛋白质的改变情况。 2.根据既往文献表述选择miR-34a作为研究对象。应用实时定量RT-PCR检测miR-34a在正常脑组织及p53变异型胶质瘤细胞系U251,p53野生型胶质瘤细胞系A172,SHG-44中的表达情况。在p53变异型胶质瘤细胞U251中转染miR-34a或NC类似物后,应用MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期分布变化,Caspase-3活性检测试剂盒检测凋亡情况;应用Transwell小室体外侵袭和迁徙实验检测转染后细胞的体外侵袭和迁移能力改变。通过既往文献,选择有争议的miR-34a靶基因SIRT1,利用实时定量RT-PCR和WB检测转染后SIRT1的mRNA和蛋白质的改变情况,从而确定miR-34a在胶质瘤细胞中对SIRT1的调节方式。 3.在p53变异型胶质瘤细胞U251中,通过WB检测miR-34a类似物和Bcl-2siRNA转染后的Bcl-2蛋白表达情况;利用MTT显色法,计算miR-34a或Bcl-2siRNA结合化疗药物(ACNU;VM-26;VCR;CDDP)的IC50值;利用WB,分别检测空白组,miR-34a组,化疗药物组,miR-34a+化疗药物组的Bcl-2蛋白表达情况。 1.相对于正常脑组织,miR-126在各级胶质瘤组织(WHOⅡ,Ⅲ,Ⅳ)和胶质瘤细胞系U251、A172和SHG-44中表达均明显下调(p0.05)。但是转染miR-126类似物后,其细胞体外生长情况、细胞周期分布、凋亡情况与NC组无明显差别;仅有Transwel实验提示其体外侵袭和迁移能力受到明显抑制(A172细胞中,p0.01;U251和SHG-44细胞中,p0.05)。荧光素酶报告分析显示,miR-126可显著抑制带有Crk 3'-UTR的报告基因活性(p0.05)。过表达miR-126可抑制Crk蛋白表达,但是对其mRNA水平没有影响,可见miR-126以转录后调节方式来调节其靶基因Crk的表达。 2.相对于正常脑组织和p53野生型胶质瘤细胞系A172、SHG-44,miR-34a在p53变异型胶质瘤细胞系U251中的表达明显降低(p0.05);miR-34a抑制U251细胞的体外生长,引起G0-G1期停滞,促进细胞的凋亡;Transwell小室实验提示,过表达miR-34a类似物后,U251细胞的体外侵袭能力明显下降(p0.01)。荧光素酶报告分析显示,miR-34a可显著抑制带有SIRT1 3'-UTR的报告基因活性(p0.01)。过表达miR-34a可抑制SIRT1蛋白表达,但是对其mRNA水平没有影响,可见在胶质瘤细胞中,miR-34a以转录后调节方式来调节其靶基因SIRT1的表达。 3.miR-34a和Bcl-2 siRNA均可抑制Bcl-2的蛋白表达。在p53变异型胶质瘤细胞U251中,联合应用miR-34a和化疗药物(ACNU;VM-26;VCR;CDDP)的IC50分别为103.1,3.4,0.8,4.3 ug/ml;联合应用NC和化疗药物的IC50分别为305.4,5.7,1.8,7.8ug/ml。基于IC50值,在U251细胞中,转染miR-34a使其对化疗药物的敏感性提高2-3倍。相对于空白组,miR-34a组,化疗药物组,miR-34a+化疗药物组更明显的抑制Bcl-2蛋白表达。 1.miRNA-126改变胶质瘤细胞的表型,从而抑制肿瘤细胞的体外侵袭和迁移能力,并且抑制其靶基因Crk的蛋白表达。2.在p53变异型胶质瘤细胞U251中,miRNA-34a担负肿瘤抑制因子的功能,并且调控其靶基因SIRT1的蛋白表达。 3.miR-34a可能通过调节其靶基因Bcl-2的蛋白表达,调节P53变异型胶质瘤U251细胞对化疗药物的敏感性。


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