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基因改造骨髓造血干细胞靶向抑制结直肠癌新生血管形成的实验研究

韦烨  
【摘要】: 目的:构建含有Tie2基因启动子增强子以及同时含有内皮抑素基因的重组慢病毒质粒并转染小鼠骨髓造血干细胞。方法:从小鼠的肝脏中提取小鼠Tie2基因启动子与增强子,进行鉴定,将之克隆到转移质粒载体pGL-3basic中,然后转入慢病毒质粒TG005。继续将获赠的内皮抑素ES基因转入改装过的转移质粒载体pGL-3basic-Tie2p/e,构建pGL-3basic-Tie2p/e-ES。同样转化入慢病毒质粒TG005。都通过293T细胞进行细胞内重组后获得TG005-Tie2p/e和TG005-Tie2p/e-ES。采用PCR的方法对完成重组的慢病毒质粒进行鉴定。从小鼠骨髓中提取造血干细胞,进行筛选,将获取的Lin-骨髓造血干细胞用构建的慢病毒进行转染,筛选转染成功的细胞并鉴定细胞内的ES产物。结果:从小鼠的肝脏成功获得了Tie2基因的启动子和增强子,克隆入慢病毒质粒载体后,也成功的酶切鉴定。获赠的ES基因也成功克隆并转入了慢病毒质粒后酶切鉴定。PCR方法证实该慢病毒质粒改造完成。提取了骨髓造血干细胞后进行了筛选,筛选后转染了相应的病毒并表达了ES。结论:慢病毒质粒载体是一种高效、简便、快捷的病毒载体,能有效的感染细胞,转入并表达相应的目的基因。 目的:评估携带了Tie2基因启动子和增强子以及内皮抑素基因的骨髓造血干细胞在抑制结直肠癌动物模型血管新生和肿瘤增殖中的作用。方法:Lovo结直肠癌细胞株建立裸鼠结直肠癌模型后,40只裸鼠分为NS、HSC、慢病毒、Tie2和ES共5组,每组8只。每组分别在尾静脉给予相应的治疗。治疗期间定期测量肿瘤的体积。治疗结束后,取肿瘤组织进行体积重量测定,Ⅷ因子和Tunel染色评价肿瘤内血管和凋亡细胞的多少。电镜观察血管形态并观察其他脏器的血管形成情况。 结果:各个实验组之间在治疗开始时,肿瘤体积无明显差异(p=0.5)。在治疗终止期,Tie2组的肿瘤比ES组明显增大(P0.01)。微血管计数的结果显示Tie2组比ES组明显增多(P0.01)。凋亡指数结果显示Tie2组比ES组明显减少(P0.01)。电镜下ES组血管破坏明显。含Tie2的两组其他脏器新生血管增生不明显。结论:携带了Tie2启动子、增强子及内皮抑素基因的骨髓造血干细胞有良好的治疗靶向性,在肿瘤血管形成区能释放内皮抑素进行治疗,对于结直肠癌的动物有明显抑制肿瘤生长的作用。


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