收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

胆道闭锁与病毒感染的动物实验研究

王玮  
【摘要】: 研究背景与目的:胆道闭锁是发生于婴幼儿的进行性炎症性胆管病,最终导致肝外、肝内胆管的梗阻及肝硬化。胆道闭锁的病因和发病机制仍不清楚。来自临床和动物实验的证据提示围生期的某种病毒感染诱发的宿主炎性反应很可能是致病原因之一。其中,巨细胞病毒和轮状病毒是胆道闭锁研究中最受关注的两种病毒。尽管研究发现胆道闭锁患儿有很高的巨细胞病毒感染率,但是临床上仍缺乏足够的证据表明这样的感染与肝外胆道损伤继而闭锁存在直接的因果联系。因此我们的研究目的之一是在原有豚鼠先天性感染模型的基础上,根据国内高致病力毒株无法通过近交系传代获得的现状,摸索围产期远交系豚鼠巨细胞病毒(Guinea pig cytomegalovirus, gpCMV)感染并导致幼鼠肝胆损伤的合适病毒滴度,建立感染模型,并在此基础上分析围产期CMV感染后肝脏实质和胆道系统的病变情况,进一步了解CMV在胆道闭锁发病中的作用;恒河猴轮状病毒感染(Rhesus Rotavirus, RRV)的胆道闭锁动物模型是目前胆道闭锁研究中最为常用的工具。由于轮状病毒对反转录基因基因技术的抵抗,使得对该病毒致病分子生物学机制研究受到极大限制。本研究的第二部分拟利用同组轮状病毒混合感染后可发生基因重排的特性,筛选单基因重排病毒株,通过病毒株的表现型分析确定RRV致胆道损伤的关键致病基因节段及其致病机制。 材料与方法:一,豚鼠围生期巨细胞病毒感染模型的建立及肝胆损伤机制研究:gpCMV于豚鼠胚胎肺成纤维细胞上传代适应。按病毒接种时间将动物分组为:1,孕晚期组,孕晚期豚鼠于孕40-43天腹腔接种1×109TCID50病毒悬液,同时设生理盐水或空白对照,活产子豚鼠出生后不同时间点处死取标本。2,新生鼠组,随机取新生豚鼠23只,于生后12-24小时腹腔注射1×108TCID50病毒悬液,于接种后不同时间点处死取标本。3,幼鼠组,随机取新生豚鼠16只,于生后10天腹腔注射1×108TCID50病毒悬液,于接种后不同时间点处死取标本。观察生长情况及黄疸症状。所有血液标本常规肝功能检测。肝脏及肝外胆道标本石蜡切片常规HE染色,原位检测细胞凋亡情况。部分标本冰冻切片原位杂交检测gpCMVmRNA在肝胆系统的表达。胆汁标本双抗酶标ELISA法检测胆汁肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)和白介素6(Interleukin 6, IL-6)表达情况。免疫组化检测CD8+细胞的表达。二,轮状病毒致小鼠胆管损伤关键基因的研究:将毒性病毒株RRV与非毒性病毒株EDIM(Epizootic Diarrhea ofInfant Mice)(体内)或TUCH(Tulane University and Cincinnati Childen's Hospital,新分离出的猴轮状病毒株)(体外)共感染。所得部分双基因或三基因重排子代与亲代,或其他子代进行回交或杂交以施加选择性压力。将培养所得病毒悬液接种MA104细胞系后琼脂糖凝胶铺板,挑选病毒斑。病毒纯化后抽提RNA,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因型分析。将所筛选出的单基因重排病毒株接种新生BALB/C小鼠,进行病毒致病性分析,部分小鼠接种后7天杀死取肝脏及肝外胆道标本进行组织病理分析。此外,将单基因重排各株接种胆管细胞系,4℃共孵育1小时后计算结合病毒量与总接种量的比例进行病毒细胞结合力分析;重排病毒株接种胆管上皮细胞系,感染剂量MOI (Multiplicity Of Infection)为1。48小时后对病毒进行滴定,了解增殖情况。各重排克隆接种新生鼠后7天后取肝外胆道标本制成匀浆,于MA104细胞系上进行滴定,了解病毒负荷量。 结果: 一,围生期豚鼠巨细胞病毒感染模型建立及分析: 孕晚期及出生时腹腔接种巨细胞病毒可引起子代豚鼠肝胆系统损伤,表现为: 1,孕晚期感染豚鼠出生体重明显低于盐水及空白对照(P=0.0029,P=0027)。生后20天,体重增长也明显落后于盐水及空白对照。新生鼠及幼鼠组病毒接种后豚鼠体重增长较对照组相比无明显差异。 2,孕晚期感染子豚鼠与空白及盐水对照组相比,出生时及生后10天TB、DB、ALT、AST水平均明显高于对照组(P<0.05),出生时及生后10天两组比较各指标无明显差异(P0.05),生后20天各指标均明显低于前两组,较对照无明显差别(P0.05)。部分子豚鼠肉眼可见大便变白,伴TB和DB水平的升高。新生鼠组病毒接种后10天AST水平较20天组和空白对照升高(P=0.027,P=0.043)。 3,63.6%的孕晚期感染子豚鼠肝脏存在单核淋巴细胞浸润为主的炎症/病理改变,炎性细胞浸润以汇管区为主。可见小叶间汇管区的破坏和纤维化改变,合并小胆管增生。伴有肝细胞气球样变性和坏死,肝内胆汁淤积。偶可见肝内微脓肿形成。新生鼠接种后10天出现肝脏病变(3/8),但病变较孕晚期组明显减轻。幼鼠组未见明显肝脏病变。 4,有肝胆损伤者肝内细胞凋亡信号密度分布基本与炎症浸润程度一致,主要表达于肝脏实质细胞和汇管区间质细胞,血管和胆管上皮偶见信号表达。孕晚期组出生时肝脏细胞凋亡指数均值6.7±1.322,汇管区细胞凋亡指数均值5.13±2.112,与对照相比有明显增加(P0.05),与新生鼠组肝损伤者凋亡指数无明显差别。 5,病毒gpCMV阳性杂交信号表达于胆管上皮及血管内皮细胞及汇管区基质内,但肝细胞内未见表达。孕晚期组豚鼠gpCMV阳性率17.27%,而新生鼠及幼鼠组豚鼠肝胆系gpCMV-mRNA阳性率(55%,50%)均明显高于孕晚期组(P=0.011,0.0180.05)。 6,新生鼠感染后10天,20天胆汁中可见HGF表达增加(P=0.0292,P=0.0461)。各组胆汁标本中未见IL-6的表达。 7,孕晚期组(8/14)和新生鼠组(3/3)肝胆损伤者有CD8+细胞表达,主要分布于肝脏实质和汇管区间质。 二,轮状病毒致小鼠胆管损伤关键基因的研究: 1,在RRV对EDIM的体内杂交中,得到单基因重排株4株,将EDIM背景单基因重排株D6/2接种新生鼠后(第4基因节段来自RRV),诱导出与RRV类似的胆管损伤症状。RRV对TUCH的体外混合感染中(包括回交及子代杂交),分离出所有22个RRV或TUCH背景下单基因重排病毒株。分别命名为RTn(RRV背景重排株,第n个基因节段来自TUCH)或TRn(TUCH背景重排株,第n个基因节段来自RRV)。n代表第1至11个基因节段。 2,致病性分析发现:重排株RT4没有致病性。相反,重排株TR4诱导出与RRV相似的黄疸症状,致病率(94.2%vs.100%,P=1.000)及致死率(88.24%vs.80.96%,P=1.000)无明显差别。58.33%的RT3感染小鼠表现胆道梗阻症状,其致病率和致死率明显低于RRV(p=0.001,0.0000.05)。相对应的TR3尽管诱导出与RRV相似的致病率(88.89%,P=0.218),77.78%的小鼠最终黄疸症状消退并存活。其余RRV背景重排病毒株疾病的表现型与RRV类似。TR7、TR1和TR2一样未诱导出任何肝胆损伤症状。其余大多数TUCH背景单基因重排株诱导—过性肝胆损伤症状,几乎所有小鼠最终存活。 3,病理分析证实各重排株的疾病表现型与汇管区及肝外胆道病理改变密切相关。 4,细胞结合能力:重排株RT4的细胞结合率(3.97%±0.93%)明显低于RRV(16.03%±1.31%,P=0.003<0.05)及其他所有RRV背景重排株(P<0.05)。其余RRV背景重排株细胞结合率与RRV无明显差别(P>0.05)。相反,重排株TR4(12.43%±2.25%)表现出明显高于TUCH:5.33%±1.27%,p=0.001)及所有其他TUCH背景重排株的细胞结合率(P0.05)。除了TR8和TR2外,其它TUCH背景重排株细胞结合率与TUCH相似(P0.05)。 5,感染性分析:克隆RT4在胆管上皮细胞系和肝外胆道的滴度均明显低于RRV(P=0.013,0.000)。相对应的克隆TR4的滴度无论在胆管细胞系还是小鼠肝外胆道均明显高于TUCH(P=0.004,0.0446)。在胆管细胞系上,所有其它RRV背景重排株的滴度与RRV类似(P>0.05),在肝外胆道大部分低于RRV(P<0.05)。TR7、TR1和TR2在胆管细胞系及肝外胆道滴度均低于TUCH(P=0.001,0.012,0.0069)。其余引起症状TUCH背景病重排株在胆管细胞系的滴度均高于TUCH(P<0.05)。等级相关分析提示TUCH背景重排株在肝外胆道平均滴度与病毒致病率相关。 结论: 一,围生期豚鼠巨细胞病毒感染模型建立及分析: 1,孕晚期和出生后即刻接种gpCMV病毒可导致子代豚鼠的感染和肝胆系统炎症损伤。 2,肝内和汇管区浸润炎性细胞以单核淋巴细胞为主,伴有CD8+T细胞的表达,提示Thl抗病毒免疫在此病理过程中发挥重要作用。 3,病毒mRNA主要表达于汇管区及内皮系统,证实了CMV病毒对胆管上皮的亲和性。其攻击胆管上皮标本并引起炎症损伤的机制待进一步研究。 4,损伤主要发生于围产期,与接种时间直接相关,表明宿主免疫状态不成熟可能是致病的重要背景因素。 二,轮状病毒致小鼠胆管损伤关键基因的研究: 1,基因节段4是决定小鼠胆道模型RRV对胆管上皮致病性的关键基因,也决定了RRV对胆管上皮感染的特异性,其机制在于影响病毒与胆管上皮细胞的结合能力,继而影响病毒在细胞内复制,其蛋白产物VP4与胆管上皮相关受体的相互作用很可能是决定胆管细胞对病毒易感性的关键环节。 2,基因节段7被替代后,病毒的致病性、细胞结合能力和胆管上皮复制均未受影响,其蛋白产物VP7相关细胞表面受体的表达可能对胆管上皮的易感性影响不大。 3,基因节段3对RRV致病性有重要影响,其被替代所带来的“中间型”可能是包括宿主因素在内的多因素相互作用的结果。 4,基因节段1,2对病毒致病性无明显影响,但两者之间可能在病毒复制中存在协同作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李桂生;;胆道闭锁[J];继续医学教育;2006年18期
2 范光明,陈丽英,郭启勇,侯阳,孙翀鹏;胆道闭锁的MRI诊断[J];中国医学影像学杂志;2004年04期
3 刘钧澄,李桂生,张志崇;影像学在婴儿阻塞性黄疸鉴别诊断中的应用[J];中华小儿外科杂志;1998年05期
4 黄志华,龚四堂,董永绥;肝外胆道闭锁与巨细胞病毒感染相关性研究[J];同济医科大学学报;1998年04期
5 魏艇;刘文英;钟麟;唐耘熳;;新生儿肝外胆道囊性病变的诊断与治疗[J];中国新生儿科杂志;2006年02期
6 冯杰雄,李民驹,汤宏峰,顾伟忠,俞少勇;新生儿肝外胆管囊性病变的临床与病理特征[J];实用儿科临床杂志;2004年08期
7 马继东,叶蓁蓁,马汝柏;胆道闭锁合并肝外胆管囊肿[J];中华小儿外科杂志;1996年05期
8 肖作源,崇雨田,王清文,唐新意,黄仰苏;婴儿黄疸与CMV感染的关系及其治疗[J];中国现代医学杂志;2000年04期
9 李士星;冯舒;张尧;时博;徐忠义;孙梅;毛志芹;黄英;;胆道闭锁的超声检查与磁共振对比分析[J];中国现代医学杂志;2010年23期
10 靳振怀,孔燕,李明磊,杜卫东;胆道闭锁患儿肝脏及肝门纤维块病理变化与临床的关系[J];中华医学杂志;1994年02期
11 肖作源!510630广州市,崇雨田!510630广州市,陈奋华!510630广州市,董阳深!510630广州市,何政贤!510630广州市;婴儿胆道阻塞11例内科治疗[J];临床荟萃;2000年04期
12 张虹,杨传民;胆道闭锁患儿肝脏组织c-kit~+细胞的表达及意义[J];山东医药;2004年21期
13 李群艳;;宝宝黄疸不退 警惕胆道闭锁[J];家庭医学(下半月);2010年12期
14 金健行;;测定血清甲胎蛋白鉴别新生儿肝炎和胆道闭锁[J];国际儿科学杂志;1975年03期
15 迟照;;新生儿肝炎和胆道闭锁的鉴别诊断[J];国际儿科学杂志;1976年05期
16 靳振怀,孔燕,李明磊;影响胆道闭锁手术近期疗效的因素及对策(附20例分析)[J];徐州医学院学报;1993年03期
17 魏珏;马雄;;胆道闭锁:一种病毒介导的自身免疫性疾病[J];肝脏;2008年04期
18 ;小儿腹部外科学[J];国外科技资料目录(医药卫生);1999年12期
19 过国英,付元凤,樊忠民,于亚平,冯宣,赵蔚南;ECT对诊断新生儿胆道闭锁的临床意义[J];新生儿科杂志;2000年05期
20 杜鹏;肝移植后发现胆道闭锁合并肝脏恶性肿瘤的病例探讨[J];肝胆外科杂志;2001年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 黄声岳;胡爽征;凌聪达;;自然组织谐波显像诊断肝外胆道疾病的临床应用[A];中国超声医学工程学会第八届全国腹部超声学术会议论文汇编[C];2010年
2 彭信逢;施庭芳;;胆道闭锁病童肝脏擬似扩散系数与肝硬化严重程度的相关(英文)[A];中华医学会第十八次全国放射学学术会议论文汇编[C];2011年
3 王翔;裘宇辉;吕成杰;高志刚;钭金法;张洪波;刘伟光;熊启星;章希圣;;Ⅰ型囊肿型胆道闭锁临床表现及外科处理[A];2011年浙江省小儿外科学术年会论文汇编[C];2011年
4 祁俊峰;;胆道闭锁患儿家长健康教育需求调查[A];全国儿科护理学术交流会议论文汇编[C];2011年
5 吴珍;秦秀群;;层级护理在1例胆道闭锁患儿肝硬化致阴囊溃疡护理中的作用[A];全国儿科护理学术交流会议论文汇编[C];2011年
6 杨凤兰;吴荣艳;;体位护理在胆道闭锁术后患儿护理中的作用[A];全国儿科护理学术交流会议论文汇编[C];2011年
7 于成文;刘道祯;穆柯晓;栾晓萍;陈芳;;新生儿及婴儿胆道闭锁的超声表现[A];中国超声医学工程学会第八届全国腹部超声学术会议论文汇编[C];2010年
8 董淳强;杨体泉;罗意革;唐咸明;陈嘉波;王红;刘强;陈超;董昆;;胆道闭锁生存2年以上患儿临床评价[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
9 李林;裴广华;王世城;李莉;郑津生;;婴儿胆道闭锁的超声诊断价值[A];中华医学会第十次全国超声医学学术会议论文汇编[C];2009年
10 李英存;张明满;蒲从伦;金先庆;康权;;胆道闭锁与婴儿肝炎综合征肝活检病理对比分析[A];中国西南地区第九届小儿科学术会议论文汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王玮;胆道闭锁与病毒感染的动物实验研究[D];复旦大学;2010年
2 赵瑞;胆道闭锁致病基因的检测及功能研究[D];复旦大学;2010年
3 王炫;活性氧产物对胆道闭锁小儿术后吗啡代谢的影响[D];复旦大学;2011年
4 刘鸿圣;64层CT阴性法胆胰管成像技术在婴儿胆道闭锁诊断中的应用研究[D];南方医科大学;2010年
5 赖东兰;胆道闭锁Kasai术后中医证候暨中药干预治疗的临床研究[D];广州中医药大学;2011年
6 宋再;胆道闭锁中LDOC1基因调控NF-κB介导炎症及凋亡反应的研究[D];复旦大学;2011年
7 董瑞;胆道闭锁中T细胞ERK通路调控甲基化敏感基因IFN-γ高表达的研究[D];复旦大学;2012年
8 杨瑛;调节性、效应性T细胞和树突状细胞在胆道闭锁患儿免疫炎症发展中的作用[D];华中科技大学;2011年
9 毛永忠;基质金属蛋白酶及其组织抑制因子在小儿胆道畸形组织中的表达及意义[D];华中科技大学;2005年
10 李士星;胆道闭锁的超声图像特征与组织学改变的相关性研究[D];中国医科大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 潘俊涛;激素干预在胆道闭锁诊治中的应用价值分析[D];郑州大学;2011年
2 郭鹏;小儿胆道闭锁中基质金属蛋白酶-2的表达及与肝纤维化及预后的关系[D];广西医科大学;2010年
3 王会;母源性微嵌合体与胆道闭锁发病机制的相关性研究[D];广州医学院;2011年
4 王文美;肝脏自然杀伤细胞在轮状病毒致小鼠胆道闭锁中的作用研究[D];华中科技大学;2012年
5 张锐忠;人巨细胞病毒感染与胆道闭锁CD4~+T细胞因子相关性研究[D];广州医学院;2010年
6 赵文涛;HMGB1在胆道闭锁发病中的作用[D];华中科技大学;2012年
7 胡传兵;BDL所致幼鼠胆道闭锁后肝脏纤维化相关生物分子的时序性变化[D];中国医科大学;2009年
8 张虹;胆道闭锁病人肝脏组织c-kit的表达及其临床意义[D];青岛大学;2004年
9 赵志祥;胆道闭锁外周血和肝脏Treg细胞及Foxp3表达水平及意义[D];华中科技大学;2010年
10 李涛;先天性胆总管囊肿肝外胆道组织学变及其临床意义[D];河北医科大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李龙;小儿胆道闭锁有救了[N];健康报;2003年
2 李群艳;治小儿胆道闭锁别超两个月[N];健康报;2007年
3 杜恩;不退黄 警惕小儿胆道闭锁[N];农村医药报(汉);2008年
4 石晓慧 赵新华;山东铝水泥公司党委用“心”做好每件事[N];中国有色金属报;2010年
5 ;胆结石答疑[N];人民日报海外版;2001年
6 胡立丽;照顾黄疸宝宝有诀窍[N];大众卫生报;2007年
7 陈继英;谨防小儿迟发性维生素K缺乏症[N];中国石油报;2003年
8 复旦大学附属儿科医院副院长、外科主任、教授 郑珊 复旦大学附属儿科医院外科医生 沈桢;新生儿黄胆需要早期诊治[N];文汇报;2011年
9 健康时报特约记者 涂晓晨;特制钢板顶起“塌方”胸[N];健康时报;2007年
10 齐军;如何知道乙肝转为肝癌了[N];健康报;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978