PI3K/Akt信号通路对DNA甲基转移酶3B基因表达的调控及其分子机制研究

【摘要】： 肿瘤细胞表现广泛而显著的表观遗传学变化,包括DNA甲基化和染色质修饰。DNA甲基化是最广为人知的表观遗传学标志,DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶(DNA (cytosine-5)-methyltransferases, DNMTs)(EC 2.1.1.37)所控制。目前,已鉴定的人类具有催化活性的DNMTs有三种：DNMT1, DNMT3A和DNMT3B,其编码基因分别位于染色体19p13.2.、2p23和20q11.2。DNMT1优先选择DNA复制过程中所形成以半甲基化状态存在的DNA双链作为催化底物,而DNMT3A和DNMT3B是从头(de novo) DNA甲基化修饰所必须的,主要为在细胞内建立新DNA甲基化类型所必须。研究发现在肿瘤细胞中存在异常DNA甲基化类型,即广泛的DNA低甲基化与某些基因启动子特异高甲基化。发生在启动子CpG岛高甲基化可影响许多与肿瘤细胞发生发展密切相关基因的表达,在恶性肿瘤以及在癌旁组织向恶性状态转变过程中均发现DNMTs升高。有学者认为具有从头DNA甲基化作用的DNMT3B在肿瘤发生发展中具有更重要作用。在细胞内PI3K/Akt信号通路调控众多信号转导途径,例如细胞生长与存活、细胞间信息传递等。异常PI3K/Akt信号通路参与肿瘤形成与转移。我们实验室已报道PI3K/Akt信号通路可以维持DNMT1蛋白稳定性,从而在肿瘤发生中起促进作用,但PI3K/Akt信号通路对DNMT3B基因表达影响及调控尚未见报道。 在本文第一部分实验中,我们在6株人肝癌(Human hepatocellular carcinoma, HCC)细胞株中发现DNMT3B mRNA表达水平与Akt1 mRNA或Akt2 mRNA表达水平相关；不同HCC细胞株的DNMT3B3 mRNA水平与DNMT3B4 mRNA水平比值有较大的差异。此外,我们发现人肝癌组织中DNMT3B基因表达明显高于其相对应癌旁组织。 为了探讨Akt是否参与DNMT3B基因调控,在第二部分实验中,我们首先检测Akt作为上游调节剂及增量调节剂的PI3K对DNMT3B基因影响,研究发现PI3K的小分子特异性抑制剂LY294002在BEL-7404细胞株中下调DNMT3B mRNA和蛋白质水平且呈剂量效应关系和时间效应关系。我们观察到LY294002对DNMT3B mRNA表达的下调降低程度在各个时间点均高于其对DNMT3B蛋白的下调程度,提示LY294002对DNMT3B基因下调可能存在着转录水平调控。此外,我们研究发现LY294002诱导DNMT3B基因表达下调并不伴随DNMT3B亚细胞定位变化。在SMCC7721细胞株及L02细胞株均观察到LY294002降低DNMT3B基因表达。接着我们还应用蛋白质合成抑制剂CHX来检测LY294002对DNMT3B基因表达下调是否与蛋白质从头机器抑制相关,结果发现LY294002不影响DNMT3B蛋白的稳定性。在第二部分实验中,我们还利用本实验室已经建立的持续性活化Akt2的小鼠胚胎成纤维细胞株(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)及稳定转染Akt1/2 shRNA的BEL-7404细胞株去研究Akt对DNMT3B基因调控作用,发现Akt2持续性活化导致DNMT3B mRNA及蛋白质水平升高,而在BEL-7404细胞中敲低Aktl／2引起DNMT3B mRNA及蛋白质水平均降低。再者,我们观察到Akt下游信息分子糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3p, GSK-3β)抑制剂氯化锂可促进DNMT3B基因表达中度增加。以上实验结果表明DNMT3B基因表达受到PI3K／Akt信号通路的调控。 为了深入阐明PI3K/Akt信号通路调控DNMT3B基因表达的分子机制,.在第三部分实验中,我们研究了LY294002对DNMT3B启动子活性的影响。首先我们依据Yanagisawa报道,构建了四个不同长度DNMT3B启动子片段,包括核心启动子序列及基本启动子序列,并将它们克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因上游,经测序比对正确后,选择构建成功载体进行下一步试验。我们通过瞬时转染方法及双荧光素酶检测系统研究启动子质粒在BEL-7404细胞中的表达情况,发现核心启动子序列表达荧光素酶活性最高,结果与文献报道中基本相同。接着我们观察了LY294002对这四种DNMT3B启动子活性影响,发现荧火虫荧光素酶及作为内参的海肾荧光素酶活性均比LY294002未处理组低,因此,我们采用LY294002处理pGL3-Basic质粒(具有基本转录活性)前后相对荧光素酶活性比值作为判断标准,若低于此标准被认为启动子活性受到抑制。结果表明,LY294002抑制DNMT3B启动子活性。因此我们认为PI3K/Akt信号通路在转录水平调控了DNMT3B基因表达。在此部分中,我们还通过对DNMT3B的mRNA稳定性研究发现,LY294002可以促进DNMT3B mRNA降解,降低DNMT3B mRNA半衰期,表明LY294002对DNMT3B基因下调也存在转录后水平调控。实验中我们观察到HuR变化亦受LY294002调控,并呈现出时间效应关系,鉴于有研究报道HuR可增加DNMT3B基因稳定性,因此,我们推测HuR可能作为LY294002促进DNMT3B mRNA降解的中介物。此部分的实验结果表明PI3K/Akt信号通路可在转录及转录后水平调控DNMT3B基因表达。 综上所述,我们首次研究发现在人HCC细胞株BEL-7404中,PI3K/Akt信号通路可以下调DNMT3B基因表达,其下调机制是在转录水平和转录后水平；这一发现对我们认识PI3K/Akt信号通路和DNMT3B基因在肝癌发生机制中的作用具有重要意义。