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细菌整合子捕获与表达耐药性基因盒调控机制的研究

魏取好  
【摘要】: 随着抗生素的广泛使用,细菌在抗生素的选择压力下,耐药菌株不断产生。其中通过基因的水平转移,获得外源性耐药基因是加快临床耐药菌株产生与播散的重要原因。整合子通过位点特异性重组捕获外源基因盒并使之表达,同时整合子可位于质粒上,或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移,使耐药基因发生播散。目前在整合子中发现的基因盒已超过80种,大部分是耐药基因盒,编码产物可赋予细菌对几乎全部临床常用药物种类产生耐药性,同一个整合子可变区可带有多个耐药基因盒,使宿主菌对多种药物产生耐药性。整合子因其在细菌耐药基因水平转移中的重要作用而受到研究者的关注。 有研究表明细菌在不利于其生长的环境中,可通过SOS反应系统调控整合酶蛋白的表达,从而影响整合子捕获基因盒的效率,同时到目前为止,整合酶蛋白催化的基因盒位点特异性重组反应体系在体外无法成功构建,表明整合子捕获与表达外源性基因盒存在着某种调控机制。由于整合子可变区基因盒中耐药基因的表达关系到宿主细菌的耐药表型,而整合子对耐药性基因盒的捕获则关系到新耐药菌株的产生与播散,因此对整合子捕获与表达耐药性基因盒的调控机制进行研究,可加深对整合子这一细菌适应外界环境变化的进化平台的理解,进而有可能开发出相关的药物来下调或阻止整合子中耐药基因盒的表达,降低整合子对外源耐药基因盒的捕获频率,从而减少耐药菌株的产生与播散。 基于上述原因,本研究以第1类整合子作为研究对象,通过分子流行病学调查了解整合子在临床菌株中的分布情况;由于位于质粒上的基因盒的表达水平还与质粒的拷贝数有关,本研究建立了一种快速确定第1类整合子是否位于质粒上的方法;然后从整合子自身结构,主要是不同可变区启动子,对整合子捕获与表达耐药性基因盒的调控机制进行研究;同时建立一种适用于转座子插入突变文库筛选的、高通量的检测整合酶介导的基因盒剪切频率的方法,以便用于进一步寻找宿主细菌中影响整合子捕获耐药性基因盒的因素。 为明确整合子在临床菌株中的分布情况,同时为后续研究提供适当的整合子、基因盒等材料,本研究首先对临床菌株整合子进行分子流行病学调查。运用PCR筛查临床菌株中的第1、2、3类整合子,第1类整合子阳性菌株对整合子可变区序列进行分析。结果176株临床菌株中第1、2、3类整合子阳性率分别为76%(134株)、1%(2株)、0%(0株),134株第1类整合子阳性菌株中有76株成功扩增出可变区,可变区中最常见的基因盒及排列为dfrA17-aadA5(34株)及dfrA12-orfF-aadA2(26株),同时在一株临床菌株中发现并命名了一种新的甲氧苄啶耐药基因盒dfrA27。表明第1类整合子在临床菌株中分布广泛,其可变区中的基因盒均为赋予宿主菌对甲氧苄啶、氯霉素及早期使用的氨基糖苷类抗生素耐药,提示整合子对耐药性基因盒的捕获与播散需一定的抗生素选择压力和时间。 整合子位于质粒上,可随质粒的移动而移动,从而加快了耐药菌株的产生以及耐药基因的播散,同时位于质粒上的整合子中基因盒的表达还与质粒的拷贝数有关,因此,确定整合子及耐药基因是否位于质粒上,对于耐药基因播散机制的研究及感染控制均十分重要。现有的基因定位方法均费时且费用高,本研究建立了一种基于实时定量PCR的方法,对临床菌株中整合子基因定位进行快速鉴定。对于同一细菌标本,分别抽提质粒、全基因组DNA或制备菌体煮沸裂解模板,运用实时定量PCR检测第1类整合酶基因(intIl)与16S rDNA在上述3种模板中的拷贝数,如果整合子位于染色体上,那么intIl拷贝数与16S rDNA拷贝数的比值在不同模板中应是相同的,相反,如果整合子位于质粒上,质粒模板中intIl拷贝数与16S rDNA拷贝数的比值(Rp)要高于全基因组DNA或菌体煮沸裂解模板中intIl拷贝数与16S rDNA拷贝数的比值(Rg或Rb)。为提高检测的特异性,将Rp/Rg或Rp/Rb大于4作为判断整合子位于质粒上的标准。运用该方法对12株临床菌株中的整合子进行定位,结果该12株细菌中Rp/Rg或Rp/Rb均大于4(5.42-24.48),推测其均有整合子位于质粒上。用PFGE结合探针杂交对12株细菌中整合子基因定位进行确认,结果该12株细菌中整合子均位于质粒上质粒大小为48.5-240 kbp不等。为进一步确认该方法可对位于染色体上的基因进行定位,用该方法对10株lacZ基因(位于染色体上)阳性菌株中lacZ基因进行定位,结果该10株细菌中Rp/Rg或Rp/Rb均小于2(0.51-1.77)。与其它基因定位方法相比,该方法具有快速、简便、费用低、适用范围广、可计算整合子所在质粒的拷贝数等优点,可广泛应用于对其它基因或DNA序列进行快速定位。 由于市场上缺乏相关的研究抗体,有关基因盒中基因在翻译水平的研究的报导较少。aadA2基因是第1类整合子基因盒中最常见的基因之一,编码产物为29 kDa的氨基糖苷-3"-腺苷酰基转移酶[AAD(3")],赋予细菌对链霉素和大观霉素耐药。aadA2基因读码框起始部位有两个起始密码子ATG和GTG,密码子GTG上游有核糖体结合位点被认为是主要或唯一的起始密码子,但从密码子ATG起始也能合成一条完整的多肽链,但至今并没有证据表明在细菌中aadA2基因可从ATG密码子起始翻译并合成有功能的蛋白。本研究通过制备抗AAD(3")蛋白特异性多克隆抗体,对含有不同起始密码子的aadA2基因翻译产物进行检测,结果证实当位于第1类整合子可变区第1位基因盒中,aadA2基因在细菌中可从上游不具有核糖体结合位点的ATG密码子起始翻译并合成有功能的AAD(3”)蛋白,这一特性使得通过第1类整合酶介导整合入attI位点的基因盒,不需带有核糖体结合位点即可起始基因盒中相应读码框的翻译,这更有利于第1类整合子表达从外界环境中捕获的基因。 第1类整合子中基因盒上游可变区启动子是影响基因盒转录水平的最主要因素之一。国内外对于基因盒中基因在翻译水平的研究大多用报告基因替代原有基因,研究结果并不能完全代表自然情况下整合子中基因盒在翻译水平的表达情况。本研究通过构建8种含有不同可变区启动子的整合子,运用第三部分制备的抗AAD(3")多克隆抗体,观察其对下游aadA2基因盒中aadA2基因在转录和翻译水平的影响。结果强Pant启动子联合有活性的P2启动子下游aadA2基因的表达水平最高,比表达水平最低的弱Pant启动子下游aadA2基因在转录水平要高出约200倍,在翻译水平要高出约15倍,并首次检测了杂合2型Pant启动子联合有活性的P2启动子下游基因盒中aadA2基因的表达水平,发现其仅次于强Pant启动子联合有活性的P2启动子及强Pant启动子联合无活性的P2启动子。 第1类整合子可变区启动子位于基因盒重组位点attI上游,可变区基因盒在可变区启动子的作用下进行转录时需经过attI位点,并使attI位点双链解开,可能影响整合酶蛋白与双链attI位点结合,从而对整合酶介导的基因盒位点特异性重组产生影响。因此本研究对第1类整合子中不同可变区启动子对基因盒整合频率的影响进行研究。运用实时定量PCR检测高表达整合酶的条件下,基因盒插入不同可变区启动子下游attI位点的整合频率,结果发现含弱Pant启动子的整合子中基因盒的整合频率最高,是整合频率最低的强Pant启动子联合有活性P:启动子的整合子中基因盒整合频率的74倍,同时发现整合子中基因盒的整合频率与P2启动子种类密切相关,在含有无活性P2启动子的整合子中基因盒的整合频率明显高于含有有活性P2启动子的整合子,在含有相同P2启动子的整合子中基因盒的整合频率与整合子可变区基因盒的表达水平成负相关。提示整合子需要基因盒高表达以适应外界环境时,可通过降低整合频率以维持整合子结构的相对稳定。 研究表明细菌处于应激状态下,整合频率会大大提高,表明不同的外界环境可影响整合子捕获基因盒的效率,而外界环境的变化是通过细菌体内不同基因表达水平的变化而影响整合子捕获基因盒的效率的,因此,宿主菌中可能存在着影响整合子捕获基因盒效率的因素。转座子插入突变文库是比较成熟的筛选细菌中影响某一表型或生物学性状的基因的方法,但现有的检测整合子中基因盒剪切与整合频率的方法都不适用于对大规模转座子插入突变文库进行高通量筛选。本研究建立一种利用“乳头状试验”检测整合子中基因盒剪切频率的方法。lacα基因的读码框由于基因盒aadA5的插入而不能翻译成有功能的β-半乳糖苷酶的α片段,当lacα基因读码框内插入的基因盒aadA5在整合酶蛋白的作用下被剪切下来,lacα基因读码框能翻译成有功能的β-半乳糖苷酶的α片段,在大肠杆菌JM109中能发生α互补现象,由于基因盒aadA5的剪切是在细菌生长过程中发生的,因此在含X-gal与IPTG的平板上,在长出的白色菌落中会出现基因盒aadA5发生剪切的细菌生长所形成的蓝色斑点,而蓝色斑点出现的早晚、数量的多少与剪切频率有关,可通过观察蓝色斑点出现的早晚以及计数白色菌落中蓝色斑点的数量来评价剪切频率。该方法具有简便、高通量、费用低等优点,可运用以对转座子插入突变文库进行高通量筛选以寻找宿主菌中影响整合酶介导的基因盒剪切频率的因素。


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